[发明专利]一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)在无菌环境中，除去洋葱鳞茎外层的3～5层鳞片叶，将洋葱鳞茎消毒后用无菌水洗涤干净，切开洋葱鳞茎，取中层靠近鳞茎内部的鳞茎叶，撕下洋葱单层内表皮块；

(2)含有农杆菌的渗透培养基的配制：将含待转化质粒的农杆菌菌株接种至YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌菌体，并重悬于预冷至4℃的渗透培养基中，使该含有农杆菌的渗透培养基浓度在OD₆₀₀＝0.2～1.5；所述渗透培养基为MS+10mM MgCl₂+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01％2-N吗啡啉乙磺酸；

(3)转化：将洋葱单层内表皮块浸浮在上述含有农杆菌的渗透培养基中，使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触5～30分钟进行转化后，夹起洋葱单层内表皮块，滤干菌液后平铺于MS固体培养基，于25℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养16～24小时。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于：所述洋葱鳞茎消毒是采用75％乙醇消毒。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于：所述农杆菌菌株为LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于：步骤(2)使该含有农杆菌的渗透培养基浓度为OD₆₀₀＝1.0

5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于：步骤(3)使农杆菌与洋葱单层内表皮块充分接触20分钟进行转化。

6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化方法，其特征在于：所述YEB液体培养液包括YEB+125ug/ml链霉素+50ug/ml卡那霉素+100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ml卡那霉素+10ug/ml利福平霉素+100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ml庆大霉素+50ug/ml卡那霉素+100mMol/L乙酰丁香酮。