[发明专利]转HGF基因骨髓基质干细胞在制备骨修复材料中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及医用配制品，具体是转基因骨髓基质干细胞在制备骨修复材料中的应用。

背景技术

骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一种由骨髓中分离获得的具有多种分化潜能的间质干细胞，取材方便、对机体损伤小，分离和扩增容易，同时还能分泌大量的促细胞和血管生长因子，许多研究表明BMSCs在人器官修复治疗中的应用前景十分广阔，如在肝损伤、骨损伤、心脏缺血等的治疗中都表现出较好的效果。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)发现于急性肝损伤动物血浆中，能刺激肝细胞的DNA合成，且在肝再生过程中起重要作用，它是一种肝素结合蛋白质，对肝素有较强的亲和力，其主要生理作用有：(1)启动肝再生；(2)促细胞分裂作用；(3)类似(细胞)扩散因子的功能；(4)肿瘤坏死作用。

《Treatment of Myocardial Ischemia with Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem CellsOverexpressing Hepatocyte Growth Factor》一文公开了一种转HGF基因骨髓基质干细胞的制备方法及其在治疗心肌缺血中的应用(Hai-Feng Duan，Chu-Tse Wu，et.MOLECULARTHERAPY Vol.8，No.3，September 2003)，该转HGF基因骨髓基质干细胞是将人HGF基因通过腺病毒载体系统转染到大鼠BMSCs中得到的，用于治疗心肌缺血。

发明内容

本发明的目的是提供转HGF基因骨髓基质干细胞的新用途，即在制备骨修复材料中的新应用。

本发明实现上述目的的技术方案是转HGF基因骨髓基质干细胞在制备治疗早期股骨头缺血性坏死的骨修复材料中的应用。

实现本发明用途的一种骨修复材料，该材料由转HGF基因骨髓基质干细胞和培养液组成，其中所述的转HGF基因骨髓基质干细胞的含量是5×10⁶～10⁸个/ml，最好是10⁷个/ml；所述的培养液可以是无血清DMEM培养液或无血清RPMI 1640培养液，最好是无血清DMEM培养液。

本发明所述的HGF为人肝细胞生长因子，其基因的序列记载于《Molecular cloning andsequence analysis of cDNA for human hepatocyte growth factor》(Miyazawa，K.，Tsubouchi，H.，Naka，D.，Takahashi，K.，Okigaki，M.，Arakaki，N.，Nakayama，H.，Hirono，S.，Sakiyama，O.，Gohda，E.，Daikuhara，Y.and Kitamura，N.Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，163(2)：967-973)；所述的骨髓基质干细胞为同种异体骨髓基质干细胞或自体骨髓基质干细胞。

本发明所述的骨修复材料的制备方法是：将转HGF基因骨髓基质干细胞按配比混悬于培养液，即可。

本发明所述的转HGF基因骨髓基质干细胞的制备方法是：

(1)利用AdMax系统，制备重组腺病毒Ad-HGF：将人HGF基因插入到穿梭质粒载体pDC316，构建穿梭质粒pDC316/HGF，将pDC316/HGF与包装质粒pBHGloxΔE1，3Cre共转染293细胞，得重组腺病毒Ad-HGF；

(2)扩增重组腺病毒Ad-HGF，采用HPLC色谱层析纯化；

(3)髂骨穿刺抽取同种异体或自体骨髓，分离、纯化BMSCs，体外培养至第二代，按腺病毒感染复数量(MOI)＝300取Ad-HGF转染第二代BMSCs，即可。

上述方法中所述的穿梭质粒pDC316/HGF可用酶切方法鉴定：将pDC316/HGF经Sac I+Sal I双酶切后将得到大小分别为2,200bp和3,913bp的片段。

所述的重组腺病毒Ad-HGF可用PCR方法鉴定：

(1)引物为：上游引物5′-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3′，下游引物5′-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3′；