[发明专利]对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白及其构建方法

权利要求书

1.一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白，所述重组蛋白由SDF-1/54R、人类免疫缺陷病毒HIV Tat和内质网定位片段KDEL片段三部分组成，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为：

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu

1                5                   10                  15

Ser His Val Ala Arg Ala Ash Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn

                 20                  25                  30

Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn

                 35                  40                  45

Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu

                 50                  55                  60

Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys

                 65                  70                  75

Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu

                 80                  85。

2.根据权利要求1所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的核苷酸编码序列为：

aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60

gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120

cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180

tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240

cgtaaggacg agctc  255。

3.根据权利要求2所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白的表达方法，其特征在于包括如下步骤：按照编码高效穿膜载体Tat和内质网定位片段KDEL片段的核酸序列人工合成两条单链寡核苷酸；在95℃下变性5min后，人工合成的单链寡核苷酸冷却至室温，即退火形成双链寡核苷酸；然后用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的双链寡核苷酸定向插入到已含有SDF-1/54R的原核表达载体pET-28a(+)中，构建成带His-Tag的原核表达克隆载体；将带His-Tag的原核表达克隆载体转入感受态克隆菌株JM109，扩增并提取重组质粒，经测序鉴定后转入表达菌株BL21，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，最后获得裂解菌体上清液，并通过Ni亲和柱获得C端带His-Tag的重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白的表达方法，其特征在于：所述两条单链寡核苷酸如下：

A：5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；

B：5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。

5.根据权利要求3所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白的表达方法，其特征在于：所述高效穿膜载体Tat的N-端带有BamHI酶切位点，所述内质网定位片段KDEL的C-端带有XhoI酶切位点。