[发明专利]太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济贝类太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)EST(Express Sequence Tag，表达序列标签)微卫星标记的筛选方法和应用。

技术背景：

太平洋牡蛎原产于日本、韩国、中国等地，是世界上养殖范围最广、产量最高的海洋贝类，也是我国重要的海水养殖种类之一。在我国，太平洋牡蛎养殖业主要分布于辽宁，山东，福建，广东等沿海地区。随着对太平洋牡蛎遗传多样性研究、遗传选育改良以及遗传图谱构建等研究工作的不断深入，对太平洋牡蛎分子标记的需求也越来越多。遗传改良或品种培育是太平洋牡蛎养殖稳定发展的动力，许多研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发太平洋牡蛎的分子遗传标记，检测太平洋牡蛎遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅助选育，对于太平洋牡蛎的育种和养殖都具有十分重要的意义。

EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆，进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150-500bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的重要来源，约有1-5％的EST含有SSR。与gSSR标记相比，从EST中获得SSR，建立EST-SSR标记更经济、更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性，从一种物种中开发的EST-SSR可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可能把太平洋牡蛎重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步进行太平洋牡蛎功能基因的研究。目前还未见关于太平洋牡蛎EST微卫星标记的研究报道。

发明的内容：

本发明的目的是提供一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法和应用。

本发明目的是这样实现的：首先利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记。

从太平洋牡蛎ESTs序列进行太平洋牡蛎微卫星分析的步骤是从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的序列，对2—6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离；采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。

对于太平洋牡蛎的ESTs设计引物，其设计引物参数为：(1)引物长度为17—25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100—300bp。

对于太平洋牡蛎利用微卫星标记进行PCR扩增，其加样参数为：总体积20μl，其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1×PCR buffer、1.5-2.5mM的Mg²⁺、Taq酶，模板量分别是50—100ng。

对于PCR产物的检测：扩增得到的产物用8—10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳—EB染色系统进行检测，电压是1—8V/cm，电泳完毕之后用EB(溴化乙锭终，浓度0.5—0.6μg/ml)染色20—30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性。

在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物：Tm值在45—65℃之间；扩增反应分别用MJ-100和BioRad-200PCR仪，PCR程序为：94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行30—35个循环。