[发明专利]一种纳豆激酶的纯化方法

权利要求书

1.一种纳豆激酶的纯化方法，包括如下步骤：

(1)发酵液预处理：将纳豆菌发酵液离心，收集上清液，上清液用0.2～0.45μm滤膜过滤，收集过滤清液；

(2)离子交换层析柱纯化：离子交换层析所用凝胶为CM SepharoseFast Flow，凝胶先用pH6.8、含6～70mM的磷酸盐缓冲液平衡好；调节过滤清液的离子浓度，使其电导率为1.6～2.2mS/cm，以6～15mL/min的流速将其加入柱中，先用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液洗涤柱床，再用pH6.8含6mM的磷酸二氢钠和0～1M氯化钠的洗脱液线型梯度洗脱，流速为5～10mL/min，用紫外分光光度计在波长为280nm处检测，收集OD₂₈₀为0.01以上的洗脱液；或把经调节离子浓度的过滤清液在加入柱之前先装入塑料桶中，加入2L已平衡好的凝胶，调pH为6.0，用搅拌机慢速搅拌吸附30分钟，吸附完成，滤掉清液，洗涤凝胶，凝胶上柱，再用pH6.8、6mM的磷酸盐缓冲液平衡柱子，后用pH6.8，含6mM磷酸二氢钠和100mM氯化钠的溶液洗脱，流速为30～100mL/min，用紫外分光光度计在波长为280nm处检测，收集OD₂₈₀为0.01以上的洗脱液；

(3)冷冻干燥：将纳豆激酶洗脱液经滤膜过滤除菌，加入添加剂及赋型剂，分装，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉剂。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(1)所述将纳豆菌发酵液离心是采用高速冷冻离心机在4～10℃，8000～16000rpm的速度下离心5～10min；或者是采用发酵罐夹层冷却法冷却至4～15℃，用高速管式离心机以10000～16000rpm的速度离心。

3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(2)所述离子交换层析所用的柱规格为内径3.5～5.5厘米，高20～30厘米；或为内径16～20厘米，高38～60厘米。

4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述滤膜为0.2μm滤膜。

5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述的添加剂为吐温-80，用量为0.05％；所述赋型剂为甘露醇，用量为2％。

6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述加入添加剂及赋型剂调节浓度为1000IU/mL后再分装。

7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于步骤(3)所述冷冻干燥是指：在冷冻温度为-40℃，真空干燥温度为5～10℃条件下冷冻干燥30～36小时。