[发明专利]互补型高容量腺病毒载体系统及其构建的疫苗和基因治疗产品

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种互补型高容量腺病毒载体系统及其衍生物，该系统包括一对 互补的腺病毒载体。本发明还涉及基于互补原理的其他病毒载体系统。该系统可 以作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体，适用于携带多种外源 基因的多价疫苗以预防传染性疾病，也适用于携带多个治疗基因的基因治疗产 品。

二、背景技术

腺病毒(Adenoviruses，Ad)是一种特征性的二十面体病毒壳体，它的基因 组是线性的双链DNA，约34kb到43kb。Ad的宿主范围很广。人源Ad可分为6 个亚群，约51种血清型。Ad可将外源基因高效的递送到细胞核中进行表达，因 而Ad载体系统作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体备受青睐。

目前开发的腺病毒载体主要以5型腺病毒(Ad5)为主，Ad5载体系统作为 基因转移载体有诸多优点。

1.安全性

1)腺病毒基因组的遗传背景比较清楚；

2)5型腺病毒比较温和，正常人感染后可以自愈；

3)通过删除、置换E1区，可造成腺病毒的复制缺陷，并且避免了E1基因 对细胞的转化作用，因此更加安全。

2.有效性

1)腺病毒可以高效的感染处于分裂期与静息期的细胞，而且携带的外源基 因可以长时间高水平地表达；

2)重组腺病毒载体可以经口服以及鼻吸用药，这种用药途径不仅方便，而 且还大大减少了注射用药造成的交叉感染。

3.生产易得性

1)腺病毒可以在宿主细胞中复制增长到很高的滴度(达到1×10¹¹pfu/ml)， 适于重组疫苗的大规模生产；

2)腺病毒的物理化学性状比较稳定，可以冷冻保存数月不失去感染能力， 所以可以方便地运输、储存重组腺病毒疫苗成品。

腺病毒载体经历了三个发展阶段。

1、第一代腺病毒载体去除了腺病毒基因组的E1和(或)E3区，其增殖必须 在能够反式提供E1区表达蛋白的互补细胞株中完成。目前可以提供E1区表达产 物的细胞株有：293，911，N52.E6和PER.C6。丧失了在非E1互补细胞中复制能 力的第一代腺病毒载体不能在活体内复制，安全性大为提高。其携带外源基因的 最大能力仅为7-8Kb。

2、第二代腺病毒载体是在第一代腺病毒载体的基础上去除了更多的早期基 因，如E2区、E4区等，载体可容纳14kb的外源基因序列。然而，去除了相关 基因的第二代腺病毒载体的生产必须在提供相应功能的互补细胞株中完成。腺病 毒基因的表达对细胞本身是一种毒性，使得这种细胞中病毒产量较低，不利于大 规模生产。

3、第三代腺病毒载体去除了所有病毒编码基因，仅保留了5’和3’末端反 向重复序列(ITR)与腺病毒的包装信号(ψ)。其可以容纳36kb的外源基因，故也 称其为辅助病毒依赖(helper dependent)高容量腺病毒。该系统的弊端是， 高容量载体的生长完全依赖于辅助病毒，缺乏选择生长优势，故产量很低。第三 代腺病毒载体需要在辅助病毒的帮助下才能够在细胞株中生产，在大规模生产和 纯化中辅助病毒的去除工作使得生产和纯化成本大大提高。

此外，在第三代腺病毒载体中，大量的异源填充物片段的选择也是一个难题。 众所周知，腺病毒外壳的包装范围为整个腺病毒基因组的75-105％，通常情况下 构建的第三代辅助病毒依赖高容量腺病毒载体骨架区长度较短，即使加上作为抗 原或者治疗性的外源基因片段，其长度也达不到腺病毒的包装范围。因此需要借 助填充物来实现高容量腺病毒载体的正常包装。目前，报道的填充物主要有λ- 噬菌体、酵母、细菌和非编码的高等动物来源(包括人来源)的DNA片段。然而， 研究表明：1)携带λ-噬菌体DNA填充片段的高容量腺病毒载体应用于动物试验时， 机体产生了针对这些填充物编码的λ-噬菌体蛋白的CTL反应，使得这些载体被体 内的免疫系统迅速清除，同时λ-噬菌体DNA在病毒生产过程中不稳定，易于导致 自动的缺失与重组。2)选用人的基因组非编码区(例如，包含基质附着区元件 的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因内含子序列)作为填充物可以提高DNA的稳定 性，且不会引起免疫反应，但是这些方法存在着填充片段介导的外源基因重组到 人类基因组中的潜在危险。

三、发明内容