[发明专利]浅色黄姑鱼泌乳激素基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种泌乳激素基因序列，尤其涉及一种浅色黄姑鱼泌乳激素的基因序列。

背景技术

泌乳激素(Prolactin，PRL)是一种多肽激素，由前腺垂体的特异的催乳素细胞合成和分泌，其名称最早来自它能刺激鸽子嗉囊的上皮细胞增生，生成嗉囊乳。它也是现在PRL生物测定的依据。1928年，法国学者Stricher和Grueler证实了有一种能诱导野兔乳汁分泌的垂体因子。近年来的研究发现，PRL除具有促进乳腺发育、启动泌乳和维持泌乳的功能外，还参与个体生殖生理的调控、免疫活动及渗透压调节、神经系统信号传递等。另外，人们还了解到，PRL的合成和分泌不只局限在垂体，生物体的其他组织和器官也具有这个能力。

八十年代以来的研究证实，机体内存在免疫-神经-内分泌调节网络。其中最引入瞩目的激素就是泌乳激素。PRL不仅可以通过内分泌机制影响免疫系统的功能，而且还作为一种由免疫系统所产生、释放的细胞因子，以旁分泌和自分泌方式调节淋巴细胞的反应。

自从1959年Pick-ford和Phillips发现用PRL来处理垂体切除的Killifish，可使移入淡水中的Killifish存活以来，到1974年PRL已经有80多种功能被发现(Nicoll，1974)，直到现在已经有300多种功能。许多PRL的功能已经被证实。主要功能是1)水和电解质平衡；2)代谢；3)生长和发育；4)繁殖；5)脑和行为；6)免疫调节。

在鱼类，PRL的生物学作用同在其他脊椎动物中一样，是多重的、变化的，包括参与渗透压调节、生殖、代谢、行为和产生黏液。

发明内容

本发明的目的是提供一种浅色黄姑鱼的泌乳激素基因序列，为浅色黄姑鱼的健康养殖和可持续发展提供新的理论依据。

根据鱼类的PRL基因的保守性，以简并引物NcPRL-FW和NcPRL-RV1、NcPRL-RV2进行两轮PCR扩增反应，第一轮PCR扩增用一般反应程序，退火温度采用50℃，72℃延伸2分钟，其扩增产物中有一条2000bp左右的片段，与设计引物时预测片段大小一致，但条带太弱，所以进行第二轮PCR扩增，以便进一步确定目的片段。第二轮PCR扩增反应反应程序前25个循环，首先第一循环用70℃退火，然后每过一循环退火温度就下降0.8℃，最后10个循环用50℃退火，72℃延伸2分钟。从电泳结果中可知，第一轮PCR扩增的产物比较模糊，目的条带不是很明显，而第二轮PCR扩增的产物目的条带比较明显，片段大小在2000bp左右，跟设计引物时预测片段大小一致。经过二轮PCR扩增可基本确定目的片段，故将这个2000bp的片段克隆、测序。测序结果经http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站blastn比对，结果与其他鱼类PRL的碱基序列相似，与河鲈(perca flavescens)和金头鲷(sparaus aurata)的PRL基因序列相似最高。

根据已扩出的PRL中间片段序列，设计特异引物5-PRL-R1和5-PRL-R2。首先以特异引物NcPRL-FW与两个反向特异引物5-PRL-R1、5-PRL-R2分别以浅色黄姑鱼DNA为模板进行PCR扩增，在56度退火温度下都可扩出与预期目的片段大小相一致的条带。NcPRL-FW和5-PRL-R1的PCR产物大小约120bp，而与5-PRL-R2的PCR产物大小在100bp左右。再以5-PRL-R1为引物，DNA为模板进行单引物PCR扩增。一般情况下都看不见PCR产物条带，用PCR纯化试剂盒直接回收PCR产物，为了引入另一端的引物，进行加尾反应，然后采用nested的引物5-PRL-R2和AAP，以加尾产物为模板进行巢式PCR扩增。从电泳结果来看，PCR产物呈一片弥散带。将与预期大小片段相近的一段弥散带割胶回收，在本实验中割取900bp～2000bp之间的凝胶带回收。将该段回收产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。随机挑10个单克隆扩大培养进行二次PCR扩增筛选，分别以5-PRL-R2和3端通用引物AP与NcPRL-FW和5-PRL-R2为引物，直接以菌液为模板进行PCR扩增筛选。其中5-PRL-R2和AAP为引物，主要检测目的片段的大小，而NcPRL-FW和5-PRL-R2为引物，则检测是否可扩出跟引物设计预期大小的片段。选取两次PCR扩增都可扩出产物，且以5-PRL-R2和AP扩增出的最大片段的菌液送测序公司测序。利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析，结果与其他动物PRL的碱基序列相似，可初步确定其为浅色黄姑鱼的PRL基因部分序列。