[发明专利]一种耐热角质酶及其编码基因和表达

权利要求书

1.一种角质酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

2.权利要求1所述角质酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求2所述的角质酶基因的表达，其特征是：

(1)角质酶编码基因的分离克隆：

角质酶编码基因的分离：

嗜热子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％十二烷基硫酸钠和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入5M的NaCl100μL和十六烷基三甲基溴化铵80μL，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25∶24∶1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL 70％浓度的乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为Thermobifida fusca总DNA；

角质酶编码基因的克隆：

根据蛋白Tfu_0883的基因设计引物P1、P2：

P1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’

P2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’

利用上述引物，以Thermobifida fusca总DNA为模版，PCR扩增角质酶基因，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到780 bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑六个菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，结果表明此角质酶基因全长906个核苷酸，编码301个氨基酸；

(2)角质酶基因的改造：

以连接了角质酶基因的pMD18-Tsimple载体为模板进行定点突变PCR，设计引物P3、P4：

P3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’

P4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’

PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布于含100mg/L氨苄青霉素-LB平板，挑选单菌落接入含100mg/L氨苄青霉素-LB液体培养基，经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果验证已突变去除Nco I位点；

(3)角质酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建：

用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素-LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；

(4)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒CUT-pET20b(+)热击转化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再于100mg/L氨苄青霉素-50mg/L氯霉素-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子：重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS，在TB培养基：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L和KH₂PO₄ 2.31g/L，中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/L异丙基硫代βD半乳糖苷诱导，降温至24℃培养，44h时产酶达180u/mL，角质酶基因实现高效表达。