[发明专利]一种交联枯草杆菌蛋白酶晶体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种交联枯草杆菌蛋白酶晶体的制备方法。

背景技术

酶(Enzyme)是活细胞内产生的具有高度专一性和催化效率的蛋白质，又称为生物催化剂。生物体在新陈代谢过程中，几乎所有的化学反应都是在酶的催化下进行的。人类对酶的认识源远流长。我国4千多年前的夏禹时代就酿酒盛行，周朝已开始制醋、酱，并用曲来治疗消化不良。酶的系统研究起始于19世纪中叶对发酵本质的研究。1858年，法国化学及生物学家路易斯巴斯德(Louis Pasteur)用一系列文章证明发酵是与生命相关的现象。但是，1897年，德国著名化学家爱德华毕希纳(Eduard Buchner)成功地用不含细胞的酵母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存在于细胞内，并不依赖活细胞。这种物质就是酶。1926年美国人萨姆纳(James Batcheller Sumner)首次提取出脲酶，并进行结晶，并指出酶的本质是蛋白质。

这些科学研究有力地推动了人类对酶的认识和使用。现在，已有二千余种酶被鉴定出来，其中有二百余种得到结晶。特别是近三十年来，随着蛋白质分离技术的进步，酶的分子结构、酶作用机理的研究得到发展，有些酶的结构和作用机理已被阐明。

作为生物催化剂(biological catalyst)，酶具有两方面的特性。它既有与一般催化剂相同的催化性质，又具有一般催化剂所没有的生物大分子的特征。例如，酶与一般催化剂一样，只能催化热力学允许的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点。此外，酶作为催化剂在化学反应的前后没有质和量的改变，并且微量的酶就能发挥较大的催化作用。酶和一般催化剂的作用机理都是降低反应的活化能(activation energy)。

同时，酶作为蛋白质催化反应，又具有高度的催化效率、高度的专一性、酶活性的可调节性、酶活性的不稳定性等特点。其中，酶的前几个特点让人们看到了酶化学应用的光明前景，但是，酶的不稳定性却严重制约了酶的进一步发展。作为蛋白质，酶催化反应要求一定的pH值、温度等温和的条件，强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、高温、紫外线、剧烈震荡等任何使蛋白质变性的理化因素都可能使酶变性而失去其催化活性。

枯草杆菌蛋白酶是一种非常重要的工业用酶。已广泛应用洗涤剂，化妆品和不对称催化合成。但枯草杆菌蛋白酶很不稳定。会自身水解而失活。交联酶晶体技术是一种非常有效的酶稳定化技术。但目前尚没有发现有关交联枯草杆菌蛋白酶的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：将提供一种工艺简单、性能稳定的交联枯草杆菌蛋白酶晶体的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：所述的交联枯草杆菌蛋白酶晶体的制备方法，包括以下步骤：

(一)在4～65℃下，将质量浓度为2％～10％的枯草杆菌蛋白酶溶液和质量浓度为10％～30％的盐溶液按体积比1∶1～1∶5的比例混合，在50～1000rpm/min的搅拌速度下，搅拌1小时～8天，溶液中有枯草杆菌蛋白酶晶体析出；

(二)在4～30℃下，将析出的晶体过滤，再经盐溶液洗涤至少4次；

(三)将洗涤过的晶体加入盐溶液中，搅拌1～3小时，得枯草杆菌蛋白酶晶体悬浊液；

(四)在4～45℃，300～1000rpm/min的搅拌速度下，将双功能交联剂慢慢加入枯草杆菌蛋白酶晶体悬浊液中，加入量为枯草杆菌蛋白酶晶体重量的1～5倍，搅拌3～16小时；

(五)将反应液经过滤或离心得交联枯草杆菌蛋白酶晶体粗品，将得到的交联枯草杆菌蛋白酶晶体粗品先用去离子水洗涤2～8次，再用缓冲液洗涤，直到洗涤流出液在280nm下的紫外吸收值小于0.5停止洗涤，得到所需的交联枯草杆菌蛋白酶晶体。

在实际制作中，为便于保存，可将交联枯草杆菌蛋白酶晶体按照重量比5％～30％的比例加入缓冲液中，搅拌1～2小时，得到交联枯草杆菌蛋白酶晶体的悬浊液。

上述步骤(一)中的温度优选为44～55℃，搅拌速度优选为280～320rpm/min，搅拌时间优选为3～7天。

上述步骤(一)、(二)和(三)中所述的盐溶液为钠或钾的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐或磷酸二氢盐溶液，并且优选钠的盐酸盐或硫酸盐溶液、或钾的硫酸盐溶液；盐溶液浓度优选15％～20％。