[发明专利]用单一特异性捕获剂定量检测分析物的新方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及采用一种特异性捕获剂定量检测一种分析物的新方法，适用于各种基于固相表面的检测平台，包括微孔板、滤膜、微磁球，等等。

背景技术

检测生物(包括人类)组织样本中特定蛋白质因子的含量，对于医学、生物学、农业、食品工业、环境保护等领域的基础研究和应用具有非常重要的意义。例如，检测病原微生物的特异性蛋白质组分是目前诊断传染病的主要手段；同样，测定癌症和心血管疾病的早期生物标记蛋白质因子含量的变化对于这些疾病的早发现早治疗和疗效观察极为重要。随着医学和生物学领域的不断进展，对各种蛋白质因子进行定量检测的需求也越来越大。

为满足这一不断增长的要求，近年来各种蛋白质和蛋白质组学检测方法应运而生，例如各种免疫检测技术、双向凝胶电泳、质谱分析和肽图谱分析等等。其中最方便、应用范围最广也是目前使用最多的是免疫检测技术中的酶联免疫吸附检测(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称ELISA；参见Engvall和Perlman，1971，Immunochemistry 8：871-4.)。ELISA的具体操作方式有若干种，其中最常用的是夹心法酶联免疫吸附检测(sandwich ELISA)，用于定量检测生物样本中某种蛋白质的浓度。夹心法ELISA采用能够和同一种抗原蛋白质的不同抗原决定簇结合的两种不同但是互相配合的抗体来完成，一种抗体和抗原的结合不干扰另一种抗体和同一个抗原分子的结合。这种方法的技术要点是：(1)将捕获抗体(capture antibody)包被在某一固相表面上(最常用的是96-孔微量板的微孔底部平面)；(2)加入待测生物样本，让其中含有的抗原蛋白质分子(分析物)与结合在固相表面上的捕获抗体特异性结合，然后洗除未结合的非特异性物质；(3)加入标有某种报道分子(酶、生物素、半抗原、荧光基团、寡聚核苷酸或其他类型分子)的检测抗体(detection antibody)，使之与固相表面上被捕获的抗原分子特异性结合，然后洗除未结合的检测抗体；(4)加入使报道分子产生信号的相关试剂(例如酶标亲和素、酶底物等)，然后用96-孔酶标仪读测信号强度，或者直接测定报道分子(例如荧光强度等)的量，或用实时PCR扩增寡聚核苷酸后检测。根据信号的强度，参照分析物的已知浓度标准校准曲线，从而确定样本中分析物的浓度。虽然夹心法ELISA的特异性和灵敏度都比较高，但是该方法的应用有一个重要局限性：如果要建立检测一种分析物的夹心法ELISA检测方法，必须拥有针对该分析物的两种不同抗体(捕获抗体和检测抗体)，而且要求这两种抗体对该分析物都拥有高度特异性和高度亲合力，同时它们之间必须互相配合，即捕获抗体和分析物的结合不影响检测抗体对同一分析物分子的结合。这些要求在很大程度上限制了夹心法ELISA的更广泛应用，这是因为，在实际工作中往往要经过很多努力、很长时间才能获得上述能够互相配合的针对同一个分析物的两种抗体。许多生物学上或临床检测上非常重要的蛋白质或蛋白质结构域，尽管多年反复试验仍然无法获得可以用于夹心法ELISA的配对抗体。而对于那些分子量较小或者抗原决定蔟较少并且靠在一起的蛋白质，就更难获得两种互相配合的抗体。有时可以获得一种拥有高特异性高亲和力的抗体，但是要找到另一种具有相似优点并且能够互相配对的另一种抗体却极为困难。这也是为什么目前市场上约有针对超过5000种不同蛋白质的抗体，但只有约400-500种蛋白质可以用夹心法ELISA进行定量检测。