[发明专利]分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种对微生物的培养和医学检验的方法及专用装置。尤其是分枝杆菌快速培养药敏及鉴定微量检测法及装置。

背景技术

第四次全国结核病流行病学抽样调查，对59个点进行全人口感染率调查结果：实验人口为365,097人，活动性肺结核患病率367/10万、菌阳肺结核患病率为160/10万，全国的结核病疫情仍很严重。在卫生部公布的27种重点传染病中，结核的发病数居第二位，死亡数居第三位，均排在SARS之前。

结核病的实验室检查是结核病的临床诊断和流行病调查的主要手段，其中细菌学检查是结核病诊断的金标准。当前结核病治疗仍然以抗结核药物化学疗法为主，但是目前对一种或多种抗结核药物同时耐药的菌株(多耐药菌)明显增多，还有一些依赖菌(即对某药有依赖性，该药存在时甚至生长更好)，因此及早检出哪些药物是敏感，哪些耐药以指导治疗十常重要。

结核的病原体是抗酸分枝杆菌。大多数分枝杆菌，特别是迟缓生长分枝杆菌菌群，例如结核分枝杆菌，牛型分枝杆菌等，生长十分缓慢。目前分枝杆菌培养药敏试验仍多采用传统方法(以下简称《规程》法)，即绝对浓度法和比例法(全国临床检验操作规程第三版2006 916～917)。在传统改良罗(L-J)氏固体培养基上，要经4～8周培养才能生长出菌落，再经4周才能获得药敏结果，不能满足临床化疗的需要。因此抗酸杆菌培养药敏检查的发展，主要集中于快速试验的研究。

近年来国内外学者都努力寻找快速的培养和药物敏感试验方法。BACTEC 460^TB快速分支杆菌自动检测装置，可将传统培养时间提早10天以上，药敏时间平均7天(林健雄，郑崇辉BACTEC460-TB自动快速检测结核菌的临床应用及评价国际医药卫生导报2001V N994)，但此法由于使用¹⁴C同位素棕榈酸作基质，放射性物质造成环境污染，在使用多年后，现在已被许多发达国家和我国禁用。

近20年来国内外着重对非放射性方法进行了研究，发表了许多这方面方法文章：

(1)生物发光法：ATP是细菌能量代谢的指标，生物半衰期短，当细菌生长抑制或死亡后，胞内ATP含量即明显下降，因而可作为活菌的标志。结核分支杆菌培养一段时间后，抽提菌内ATP，然后加入生物发光试剂，通过光度计进行定量检测。可在5-7天内获得结果，但同时存在无法区分致病菌和非致病菌，ATP抽提烦琐等缺点，培养后取菌样抽提过程易造成污染，需进一步完善才能用于临床。

(2)噬菌体生物发光检测方法：采用生物发光技术检测可表达荧光素酶的分枝杆菌噬菌体phage40，对不同细菌的发光反应和药敏试验进行测定。在含抗结核药物的培养基中，耐药结核菌的发光强度比非耐药结核菌强，其强度差异有显著性意义。phage40的药敏试验结果与常规罗氏培养基法符合率一致，可在72h内得到结果。(吕斌，徐顺清，陈志飞用重组噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性  中华检验医学杂志2000V23N3 144-147)

(3)流式细胞仪法：乙酰乙酸荧光素是一种非极性荧光物质，能够通过主动转运和被动扩散的方式透过分支杆菌的细胞壁和细胞膜。活的分支杆菌胞质中非特异性脂酶能迅速水解外来的FDA为游离的荧光素，而死菌因活性脂酶大量减少，水解FDA的作用弱，游离荧光素产生很少。流式细胞仪可以检测带荧光的分支杆菌，用于结核分支杆菌的活菌诊断，24h得出药敏试验结果(Norden Ma，Kurzynsik TA，Bownds SE，etal.Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis(流式细胞仪快速检测带荧光的分支杆菌H37Ra)by Flow Cytometry[J].J.ClinMicrobiol，1995，33(5)：1231-1237.)。由于FDA也可以进入其他细菌而被菌内脂酶水解而发荧光，影响检测结果的特异性。乙酰乙酸荧光素可以自然水解，导致假阳性。培养样品导入流式细胞仪过程为开放操作，易于造成污染。加之流式细胞仪设备昂贵，技术要求高，因而很难在临床推广。