[发明专利]三七皂苷体内五种活性成分的同时定量分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及三七总皂苷中微量物质的分析技术，尤其是同时对这些微量物质进行定量分 析并用于药代动力学研究的技术。

背景技术

众所周知，由于中药(单方或复方)成份的复杂性、各成分含量差异较大、成份之间存 在复杂的相互作用，给中药血药浓度的监测及药代动力学研究带来很大的困难。三七总皂苷 是多组份中药中的典型代表，文献报道三七总皂苷中所含的皂苷类成份多达60多种^[1]，最近 几年来国内有些学者开展了三七皂苷及其不同制剂的含量测定及药代动力学研究，但多数是 借助高效液相色谱仪对单一皂苷成分如Rg1或Rb1进行研究^[2-4]。由于皂苷类成份的低紫外吸 收使得现有研究方法灵敏度极低没法满足生物样品的测定要求^[4]。使得三七总皂苷在机体内 的药代动力学研究受到很大的限制。

研究内容

根究三七总皂苷的研究现状，为更好地评价三七总皂苷的体内药动学特征，本发明建立 了一种高灵敏度的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术分析方法，不仅克服了传统分析方 法中由于皂苷类物质低紫外吸收带来的低灵敏度分析技术问题，而且还对多种微量的皂苷类 成份进行了定量分析，为三七总皂苷在机体内的药动学研究提供了研究基础，也为中药多组 份同时定量分析提供了技术参考。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：采用正丁醇液-液萃取方法对血浆样品进行 处理；建立血浆样品中三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1同时测定的色谱条件为：色谱柱： Luna-C₁₈柱，150×2.0mm(ID.)，5μm(Phenomenex，USA)，柱温：40℃；流动相：水相(A相)， 0.5mM的氯化铵溶液；有机相(B相)，乙腈，梯度洗脱，流速为0.2ml L^-1。质谱条件为：干 燥气(氮气)流速为1.5Lmin^-1；曲型脱溶剂装置(CDL)温度为250℃；加热块(Block)℃为200℃； 检测器电压为1.6kV；探针(probe)电压为4.5kV；裂解器电压为-70V。离子化方式：电喷雾离 子化，负离子方式；选择性离子(SIM)检测：各成份荷-质(m/z)比分别为967.75、835.40、 981.80、981.80和1143.65。在上述条件基础上对三七总皂苷在血浆样品中的专属性、线性 关系、回收率、日内(间)差、稳定性和最低定量限进行了考察，并利用所建立的方法进行了 体内三七总皂苷的药代动力学研究。

本发明的有益效果是：同时对血浆中三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1进行定量分析， 方法可靠、简便，分析时间短，为三七总皂苷的药代动力学研究提供了分析技术保障，也为 中药多组份定量分析研究提供了技术上的参考。

具体实施方式

1、含三七总皂苷血浆100μl，精密加入浓度为500ng mL^-1的内标地高辛溶液10.0μl，漩 涡混匀器上混匀30s，加入1.0ml的水饱和正丁醇，继续混匀3min，将混匀物置于离心机中， 8000rpm离心5min，取上层有机相0.8ml至干净的Eppendorf管中，真空减压浓缩干燥器上 将有机相正丁醇挥干，残渣加入100.0μl甲醇，漩涡器上震荡融解2min，将溶解液置于高速 低温冰箱中22000rpm离心10min，取上清液10.0μl上清液注入HPLC-MS仪进行分析。

2、分析的色谱条件如下：色谱柱：Luna-C₁₈柱，150×2.0mm(ID.)，5μm(Phenomenex，USA)， 柱温：40℃；流动相：水相(A相)，0.5mM的氯化铵溶液；有机相(B相)，乙腈。梯度洗脱程 序见下表，流速为0.2ml L^-1。

3、分析的质谱条件如下：岛津2010型LC-MS电喷雾离子源参数如下：干燥气(氮气)流 速为1.5L min^-1；曲型脱溶剂装置(CDL)温度为250℃；加热块(Block)℃为200℃；检测器电 压为1.6kV；探针(probe)电压为4.5kV；裂解器电压为-70V。离子化方式：电喷雾离子化，负 离子方式；选择性离子(SIM)检测：各成份荷-质(m/z)比分别为967.75、835.40、981.80、 981.80和1143.65。