[发明专利]柠檬酸浓度的测定方法及柠檬酸诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医药、食品、环境等领域内对柠檬酸浓度的检测，尤其涉及酶比色法及偶联法测定柠檬酸浓度的方法，以及由此制得的柠檬酸诊断试剂盒，属于柠檬酸浓度分析检测技术领域。

背景技术

柠檬酸主要用于食品、饮料行业作为酸味剂、调味剂及防腐剂、保鲜剂，也用于制备医药清凉剂，还在化工行业、化妆品行业及洗涤行业中用作抗氧化剂、增塑剂、洗涤剂。

强制性国家标准GB17203-1998《食品添加剂柠檬酸钙》规定，柠檬酸钙含量为98.0～100.5％。国家质检总局组织对食品添加剂剂柠檬酸其盐类(柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙)产品质量进行了国家监督抽查。抽查中发现的主要质量问题是柠檬酸钙含量不合格，抽查中有个别产品食品添加剂柠檬酸钙含量超过国家标准规定的要求，主要是原料碳酸钙转化不完全，成品中存在杂质。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定柠檬酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的柠檬酸诊断试剂盒。

为实现本发明的目的，一种酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)测定柠檬酸浓度的方法，利用柠檬酸合成酶为作用酶、苹果酸脱氢酶为显色酶，对待测样品中的柠檬酸进行检测，采用以下步骤进行：

将测定的样品与含有辅酶A、柠檬酸合成酶、还原型辅酶、苹果酸脱氢酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出柠檬酸浓度的大小。

上述酶比色法及偶联法测定柠檬酸浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。

实现本发明柠檬酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液          20～500mmol/L，

稳定剂          1～4000mmol/L，

还原型辅酶      0.1～0.35mmol/L，

辅酶A           1～50mmol/L，

柠檬酸合成酶    1000～80000U/L，

苹果酸脱氢酶    1000～80000U/L。

试剂盒可以是干粉状态，也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如：

双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分：还原型辅酶、辅酶A可以放在试剂II；试剂II中的柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在1～4000mmol/L、或0.1％～100％体积比范围之内。

还可以将试剂配成如下三试剂：

与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶、辅酶A可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的苹果酸脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的柠檬酸合成酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。