[发明专利]胸腺素α1的固相合成工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种C端为Asn的多肽，尤其涉及胸腺素α1，特别为胸腺素α1的固相合成工艺。

背景技术

胸腺素α1是哺乳动物胸腺中存在的单一组分的多肽化合物，是与免疫细胞发育分化相关的分子，具有使T淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，能破坏其感染的靶细胞，还可激活NK细胞活性，促进与免疫相关的细胞因子的产生。胸腺素α1的活性较胸腺五肽高10到1000倍，是复合治疗慢性乙肝、丙肝、免疫缺陷综合症药物，在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤治疗中也发挥了较大的作用。胸腺素α1于1997年由意大利赛生(Sciclone)公司开发上市，现已被24个国家批准用于慢性乙型肝炎(HBV)的治疗，在欧美日等国也用于治疗丙型肝炎(HCV)、肝细胞癌及增强免疫疾病的治疗。

胸腺素α1的结构是由28个常规氨基酸残基和N端氨基酸乙酰化的多肽。最近的胸腺素α1及其类似物的制备方法主要有两种，其中一种是采用生物合成技术，在2003年1月1日公开的中国发明专利(CN1388133A)里，利用人工基因合成技术获得胸腺素α1的全序列。另一种为固相合成方法，“化学学报”2004年第55卷第2期《胸腺素α1的DIC固相化学合成与鉴定》中提到，以Wang Resin为起始原料，通过激活试剂DIC+HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接；“天津药学”2001年6月第13卷第3期《Fmoc新型固相法合成胸腺素α1及其反应途径》中提到，以HMP树脂为起始原料，通过激活试剂DCC+HOBt将Fmoc-Asn(Trt)-OH与树脂相连接。

综合参考国内外关于胸腺素α1制备方法以及相关的合成报道文献，发现这些技术都存在一些不足，主要表现在：①生物合成技术单分子大肠杆菌难以表达，难以规模化生产；②BOC策略合成、裂解时使用HF，反应剧烈，带有强腐蚀性，对生产人员和环境危害较大；③常规固相合成方法难以获得高纯度(＞98％)的胸腺素α1，或者收率低(＜5％)，导致生产成本高。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的上述问题，提供一种高收率、低成本、反应条件温和、生产安全、环境污染小、有利于实现产业化的胸腺素α1的固相合成工艺。

本发明的技术解决方案是：胸腺素α1的固相合成工艺，其特征在于该方法包括下列步骤：

1)以Fmoc-Rink Amide AM树脂或者Fmoc-Rink Amide MBHA树脂为起始原料，去除Fmoc后与Fmoc-Asp-X的侧链羧基相连，得到Fmoc-Asp(树脂)-X；

2)其余27个氨基酸按照胸腺素α1依次合成；

3)N端氨基酸用乙酸酐和吡啶进行乙酰化处理；

4)用裂解试剂进行切割得胸腺素α1粗肽，用乙醚沉淀粗肽；

5)用反相高效液相法纯化分离。

进一步地，上述的胸腺素α1的固相合成工艺，其中，步骤1)中羧基保护基团X为OtBu、OAll或Dmab。

更进一步地，上述的胸腺素α1的固相合成工艺，其中，步骤2)中氨基酸的激活试剂为A+B+DIPEA，其中A为TBTU、HATU、HBTU或HCTU，B为HOBt、HOAT或Cl-HOBt。

更进一步地，上述的胸腺素α1的固相合成工艺，其中，步骤3)乙酸酐和吡啶的摩尔用量分别为N端自由氨基的5-30倍。

再进一步地，上述的胸腺素α1的固相合成工艺，其中，步骤4)裂解试剂是：三氟乙酸/苯甲硫醚/1，2-乙二硫醇/苯甲醚，按照90∶5∶3∶2的体积比配制而成，裂解切割是在室温下反应2-3小时，沉淀粗肽学时乙醚体积用量是裂解试剂8-10倍。

与已有的胸腺素α1合成方法相比，本发明胸腺素α1的固相合成工艺具有以下优点：

(1)以Fmoc-Asp-X为C端氨基酸，利用Asp侧链与氨基功能树脂相连，改变肽链在树脂上的空间位置，有利于后面的氨基酸顺利连接。实验证明，普通以Asn为末端氨基酸的方法，在12位以后氨基酸均存在偶联率低等问题，合成所得粗肽纯度较差，且主峰前后杂峰多、不易纯化，纯度难以达到98％，收率一般在5％左右；而采用本发明Asp方法，不但提高了粗肽的纯度，可以达到60％，而且减少了杂峰，有利于产品的纯化分离，分离后产品纯度可到99％，收率提高到20％。收率的大幅提高，降低了生产成本，有利于实现规模化、产业化生产。具体如下表对比所示：