[发明专利]一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达

说明书

技术领域

一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达，属于分子生物学领域。涉及一种编码谷氨酰胺转胺酶酶原的新DNA分子和其编码的谷氨酰胺转胺酶酶原。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ谷氨酰胺转胺酶，Transglutaminase，简称MTG，EC 2.3.2.13)，又称转谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基转移酶，可以催化蛋白质分子内、分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，从而进一步改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品，被誉为“21世纪超级粘合剂”。

谷氨酰胺转胺酶在食品加工中的应用主要包括：(1)通过催化蛋白质分子之间发生的交联，改善蛋白质的溶解性、起泡性和乳化性等重要性能；(2)将某些人体必需氨基酸(如赖氨酸)共价交联到蛋白质上，防止美拉德反应对氨基酸的破坏，提高蛋白质的营养价值；(3)用该酶交联过的酪蛋白脱水后可形成耐热、耐水性的薄膜，能够用作食品包装材料；(4)用于包埋脂类或脂溶性物质，催化蛋白质分子的去酰胺化。

谷氨酰胺转胺酶在医药领域也有很好的应用前景。谷氨酰胺转胺酶(即人体凝血因子XIII)在凝血过程中能够加固纤维结构；在表皮角质化过程中形成角化层；加速伤口愈合；参与受体介导的蛋白质和多肽激素的胞吞作用等。这些生理功能也说明谷氨酰胺转胺酶已成为医药工业研究者所瞩目的焦点。最近在化妆品、纺织工业上也有学者开始关注谷氨酰胺转胺酶，相关的应用研究正在展开。

目前报道的生产谷氨酰胺转胺酶的方法主要有从动植物组织中提取，从微生物发酵法生产两种。上世纪六十年代以来，对来自动物体(主要是豚鼠肝脏)的谷氨酰胺转胺酶的纯化方法、性质以及应用进行了广泛研究。由于来源稀少、提取工艺复杂，因此这种酶的售价较高，很难应用于食品工业。因此期望能够找到产谷氨酰胺转胺酶(TG)的微生物菌株，1989年，Ando，Motoki等人(AndoH et，al.Agric Biol Chem，1989，53：2613-2617)首先报道用微生物发酵法生产MTG。国内对发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究起步较晚。江南大学环境技术研究室是国内较早开展微生物法发酵生产谷氨酰胺转胺酶的科研单位。研究小组郑美英等人以茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)为出发菌株，通过发酵优化最高达到3.37U/ml；柏映国等人用传统方法筛到一株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicu；CCTCC M203062；中国专利：03152956.9，2003)，通过150L中试，MTG酶活最高达到4.20U/mL。

近年来，随着基因工程技术的发展，人们开始尝试采用重组DNA技术构建工程菌来进一步提高MTG的发酵水平。Washizu等人和Takehana等人首先进行了MTG的克隆与表达，但是酶活水平都很低，无法达到工业化生产的要求。Date等人将编码谷氨酰胺转胺酶的基因转入Corynebacterium glutamicum中表达，并同时将一段可以特异切割谷氨酰胺转胺酶前提酶原的蛋白酶(SAM-45)基因转入宿主表达，结果获得了很高的产量，最高酶活达到16U/mL。国外在基因工程方面的研究主要包括采用不同的表达载体，融合不同来源的酶原区域，共表达切割酶原的蛋白酶基因，利用不同的宿主等，在产酶机理和分子水平上有深入研究，国内在2004年周建等利用大肠杆菌宿主将枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因与硫氧还蛋白融合表达，但是必须经过复杂的复性操作后才得到较低的生物活性；江南大学唐名山等利用茂原链霉菌的MTG基因在大肠杆菌E.coliM15中尝试表达，产物主要为包涵体，通过Ni-NTA亲和柱分离纯化和稀释法复性。徐斌等同样利用茂原链霉菌的TG基因在大肠杆菌中表达，表达产物也是包涵体。Christian K等(Christian K.et，al.Enzyme and Microbial Technology2007，40：1543-1550)利用茂原链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因在大肠杆菌中获得部分可溶性表达，但酶活不高。利用基因工程菌获得可溶性表达有活性的谷氨酰胺转胺酶还需要进一步研究。