[发明专利]一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法

说明书

技术领域

一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，属于生物制品的分离纯化技术领域。本发明涉及一种以阳离子交换色谱和疏水色谱为主要技术手段的谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，简称TGase)是一种催化酰基转移反应的转移酶，能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品。现在已经广泛应用在许多方面：在食品加工过程中，可以保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应，从而保护限制性氨基酸，提高食品的营养价值；在肉制品加工中，谷氨酸胺转胺酶的交联作用将一些低价值的碎肉进行重组，从而改善其外观、结构、风味，以提高其营养价值和市场价值；在水产品保鲜中，可通过形成可食性的薄膜，包埋脂类物质；在乳制品加工中，提高蛋白质的营养性；在医药工业中，谷氨酸胺转胺酶包埋脂类或脂溶性物质，形成耐热耐水性的膜；在非肉类的豆类食品中，提高食品的弹性和持水能力；在纺织行业，还被用来提高蚕丝织物以及羊毛织物的品质。

Tgase发酵过程中以酶原(Pro-TGase)的形式分泌，Pro-TGase须经过谷氨酰胺转氨酶激活蛋白酶(TGase-activating protease)的切割活化，获得成熟的具有活性的TGase.而这一激活过程受一种分子量12kDa的蛋白质抑制，即谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子。这一抑制因子对TGase活化过程起调控作用，但具体的调控机制目前还不清楚。对谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子调控机制的研究将极大的促进发酵生产TGase水平。谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化是对其调控机制研究的基础，因此，采用简单有效的方法对谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子进行分离纯化成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，采用阳离子交换色谱和疏水色谱为主要技术手段，有效简便的分离纯化吸水链霉菌所产谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子，使之达到电泳纯，为进行进一步的调控机制研究奠定基础。

本发明的技术方案：一种谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的分离纯化方法，工艺步骤为：

(1)乙醇沉淀

将吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13的发酵液离心去除菌体后，加入乙醇至终浓度为70％，缓慢搅拌使之完全溶解，并于4℃静置10-20min，10000rpm冷冻离心15-30min，收集蛋白沉淀，将沉淀复溶于适量pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液中，制成上样液。

发酵所用菌种吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13已在中国专利ZL03152956.9公开，授权公告号CN 1208452 C，授权公告日2005年6月29日。

(2)阳离子交换色谱

采用Fractogel EMD SO₃^-阳离子交换柱以pH 5.0的HAc-NaAc缓冲液平衡，将1个柱体积的上样液以0.5-1mL/min的速度加入阳离子交换色谱中，用pH 5.0的含0-1M NaCl梯度的HAc-NaAc缓冲液以同样的速度洗脱至280nm紫外吸收峰为0，谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分在梯度洗脱时的第一个出峰，收集活性峰；

(3)疏水色谱

阳离子交换柱上获得的活性部分用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液平衡过夜，Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水柱以10个柱体积含有10％NaCl的pH 7.0的Tris-HCl缓冲液平衡，将1个柱体积的上样液以0.5-1mL/min的速度加入疏水色谱中，用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液以同样的速度洗脱至280nm紫外吸收峰为0，再以1个柱体积的去离子水洗脱，收集活性峰，即为所需要的电泳纯谷氨酰胺转胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液。

本发明的有益效果：

(1)分离工艺简单，周期短。本分离纯化工艺由酒精沉淀、阳离子交换色谱和疏水色谱三部分组成，硫酸铵沉淀约为1h，阳离子交换色谱约为3h，疏水色谱约为3h。