[发明专利]一种角质酶的分离纯化方法

说明书

技术领域

一种角质酶的分离纯化方法，本发明涉及一种以疏水色谱为主要手段的角质酶的分离纯化方法，属于生物制品分离纯化技术领域。

背景技术

退浆后未经加工的织物，其吸水性及白度均不尽人意。传统精练经浓碱煮练后，需消耗大量清水进行漂洗，产生大量污水，对环境极为不利。如采用生物酶对织物进行精练，以除去非纤维素杂质，可大大降低对环境的影响。角质酶可分解纤维表面的角质，并将附着的脂质等杂质一同从棉纤维表面除去，同时对棉籽壳也有一定的降解作用。将其和果胶酶复合使用，效果更好。同时Thermobifida fusca为嗜热菌，所产角质酶耐热性好，适合纺织工业的需要。角质酶的分离纯化是进行蛋白质测序、性质应用分析和进一步构建基因工程菌，提高角质酶产量的基础，因此，采用简单有效的方法对角质酶进行分离纯化成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种角质酶的分离纯化方法，采用疏水色谱为主要手段的有效简便的方法分离纯化野生菌所产角质酶，使之达到电泳纯，为进行进一步的蛋白质测序、性质应用分析和基因工程菌构建奠定基础。

本发明的技术方案：一种角质酶的分离纯化方法，工艺步骤为：

(1)硫酸铵沉淀

将嗜热子囊菌Thermobifida fusca发酵液离心去除菌体后，上清液中加入硫酸铵粉末，达到60％-80％硫酸铵浓度，70％的硫酸铵浓度更佳，缓慢搅拌使之完全溶解，并于4℃静置4-24h，静置4h更佳，将静置后的混合液12000rpm冷冻离心15-30min，冷冻离心15min更佳，收集蛋白沉淀，将沉淀复溶于适量pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，并加入硫酸铵粉末达20％的硫酸铵浓度，制成上样液；

(2)疏水色谱

采用Phenyl HP疏水柱，以含有20％硫酸铵的pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡过夜；将1个柱体积的上样液以0.5-1mL/min的速度加入疏水色谱中，上样速度1mL/min更佳，用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液以同样的速度洗脱至280nm紫外吸收峰为0；然后以1个柱体积的去离子水洗脱，收集活性峰，即为所制备的电泳纯角质酶溶液。

本发明的有益效果：

(1)分离工艺简单，周期短。本分离纯化工艺由硫酸铵沉淀和疏水色谱两部分组成，硫酸铵沉淀约为5h，疏水色谱约为3h。

(2)作用条件温和，见效快。角质酶疏水性很强，必须用没有离子强度的去离子水才能将其洗脱，因此不用经过高盐洗脱、梯度洗脱等步骤，可以直接用pH7.5的Tris-HCl缓冲液将所有杂蛋白去除，随后用去离子水洗脱，以减少操作时间。

附图说明

图1角质酶Phenyl HP疏水柱层析图谱

具体实施方式

以疏水色谱为主要手段对角质酶进行分离纯化，其具体步骤如下：

(1)野生菌发酵生产角质酶

以嗜热子囊菌Thermobifida fusca为出发菌株，将培养至对数生长期的种子接入发酵培养基中，50℃培养50h，得到含角质酶的发酵液。嗜热子囊菌Thermobifida fusca菌株已公开，见【应用与环境生物学报】2005，11(5)：608～610。

(2)硫酸铵沉淀

将发酵液12000rpm冷冻离心10min去除菌体后，在发酵上清液中缓慢加入70％的硫酸铵粉末，并缓慢搅拌使之完全溶解，于4℃静置4小时使蛋白充分沉淀，12000rpm冷冻离心15min，收集蛋白沉淀，将沉淀复溶于pH7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入20％硫酸铵制成上样液。

(3)疏水色谱

疏水柱以含有20％硫酸铵的pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡，将1个柱体积的上样液以1mL/min的速度加入疏水色谱中，用pH7.5的Tris-HCl缓冲液以同样的速度洗脱至280nm紫外吸收峰为0；再以1个柱体积的去离子水洗脱，收集活性峰，即为所制备的电泳纯角质酶。