[发明专利]亚铁离子诊断/测定试剂盒及亚铁离子浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种亚铁离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚铁离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

铁和总铁结合力在人体代谢过程中极为重要。铁是人体正常生理过程中不可缺少的物质。人体含铁约3～5g，其中70％存在于红细胞血红蛋白中；25％分布在单核巨噬细胞系统(即网状内皮系统，肝、脾、骨髓中铁蛋白和含铁血黄素)；4.9％分布于肌红蛋白、细胞色素、含铁的酶；0.1％为循环血浆中的铁。

人体内的铁来源于食物，主要在十二指肠和小肠上部被吸收。体内铁以铁蛋白和含铁血黄素形成贮存在骨髓、脾和肝脏内。有少量铁与血浆转铁蛋白结合，通过血浆输送至各组织，被利用或被贮存。

血清铁的测定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于灵敏度不高及基底的干扰，比分光光度法可靠性差。分光光度法应用一类含-N＝C-C＝N-结构的生色原，与亚铁形成五元环，产生紫红色。较早使用的有联吡啶和红移菲罗啉；近来多推荐灵敏度较高的亚铁嗪。此外，尚有应用铬天青S与高铁的反应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定亚铁离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的亚铁离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行亚铁离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明亚铁离子浓度测定方法原理如下：

顺乌头酸+水  乌头酸酶  柠檬酸

柠檬酸+辅酶A  柠檬酸合成酶  乙酰辅酶A+草酰乙酸+水

乙酰辅酶A+二氧化碳+还原型辅酶  丙酮酸脱氢酶  丙酮酸+辅酶A

                                             +辅酶

这种方法应用需要亚铁离子激活的乌头酸酶(aconitase；EC 4.2.1.3)酶(偶)联柠檬酸合成酶(citrate synthase；EC 2.3.3.1 & EC 2.3.3.3)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应速率比色法。乌头酸酶在亚铁离子激活下酶解顺乌头酸产生柠檬酸，再通过(偶)联合柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算亚铁离子的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明亚铁离子诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液        100mmol/L

稳定剂        500mmol/L

还原型辅酶      0.25mmol/L

顺乌头酸        10mmol/L

辅酶A           5mmol/L

二氧化碳        30mmol/L

乌头酸酶        6000U/L

柠檬酸合成酶    12000U/L

丙酮酸脱氢酶    18000U/L

本发明的亚铁离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、顺乌头酸、辅酶A、二氧化碳、还原型辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶。

顺乌头酸、辅酶A、二氧化碳、还原型辅酶、乌头酸酶、柠檬酸合成酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。