[发明专利]果糖诊断/测定试剂盒及果糖的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种果糖诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定果糖浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

国家相关部门于日前发布实施了《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》标准，该标准根据糠氨酸和果糖两种特定物质在液态乳中的含量，来判定是否添加了“复原乳”，乳中果糖含量(mg/L)与糠氨酸含量(每100g蛋白质所含毫克数)比值小于2时，则可判定添加了复原乳。

掺杂使假乳往往口感较差，有些不法奶商常常在掺假奶中加入价格便宜的白砂糖来改善鲜奶口感。测蔗糖就是为了遏制部分奶商的这种不法行为。测蔗糖的方法之一是先将蔗糖在强酸性条件加热分解生成葡萄糖和果糖，然后再测果糖含量。

果糖为分析精液质量的一个重要指标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定果糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的果糖诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行果糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明果糖浓度测定方法原理如下：

果糖+α-D-葡萄糖-1-磷酸蔗糖磷酸化酶蔗糖+磷酸根

磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶

                  甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶

这种方法应用蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases；EC 2.4.1.7)偶联甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；EC1.2.1.59)酶促反应速率比色法/终点法。蔗糖磷酸化酶酶解果糖反应产生磷酸根，再通过偶联甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算果糖的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明果糖诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                     100mmol/L

稳定剂                     500mmol/L

辅酶                         3mmol/L

葡萄糖-1-磷酸               10mmol/L

甘油醛-3-磷酸               20mmol/L

蔗糖磷酸化酶                10000U/L

甘油醛-3-磷酸脱氢酶                12000U/L

本发明的果糖诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸、蔗糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

辅酶、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸、蔗糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、葡萄糖-1-磷酸、甘油醛-3-磷酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶。