[发明专利]一种从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞二磷胆碱的分离纯化方法。尤其是从生物转化或多酶反应液中，采用新型离子交换树脂组合柱层析，分离纯化胞二磷胆碱的方法。

背景技术

胞二磷胆碱(cytidine diphosphate choline，简称CDP-Choline，CDP-C)是机体卵磷脂合成的重要中间体，是磷脂代谢所必需的辅酶。在临床上，CDP-C在脑中磷脂代谢受损的状态下可以改善磷脂的代谢，从而促进意识的恢复。对脑外伤、脑手术所致的意识障碍，以及对一些慢性病如脑卒中后遗症、帕金森氏病、中枢性眩晕、耳鸣、青光眼和感觉性神经耳聋有一定的疗效。

CDP-C可用化学合成和生物合成制备。化学合成CDP-C通常需要制备一些中间体(如胞苷酸吗啡胍盐或胞嘧啶二磷酸二酚等)，工艺烦琐；虽然Kennedy曾采用加入大量的二环己基羰基二亚胺(DCC)^[2]作缩合剂直接缩合胞苷酸(CMP)和磷酸胆碱来制备CDP-C(Kennedy E.P.，J.Biol.Chem，1956，222：185)，但DCC试剂价格昂贵，用于工业生成成本过高；Kikugawa^[10](Kikugawa，Chem.Pharmaceut.Bull，1971，19：1011)和上海实验生物研究所(海实验生物研究所核酸研究组，生物化学与生物物理进展，1975，1：19)曾采用对甲苯磺酰氯代替DCC作缩合剂直接缩合CMP和磷酸胆碱来制备CDP-C，但仍存在着操作要求严格和转化率不高等问题。

利用生物体内的相关酶系进行生物法合成，具有反应条件温和、转化率高、成本低等特点，因此近年CDP-C的生产大多都采用生物合成。

生物合成中，以CMP与磷酸胆碱(盐)为底物生物合成CDP-C最为成熟。如文献给出了利用酵母生物转化合成CDP-C的生产条件：pH8.0，20mmol/L CMP，酵母550g/L，磷酸盐缓冲液为200mmol/L，葡萄糖1000mmol/L，磷酸胆碱90mmol/L，硫酸镁20mmol/L，反应时间在24-32小时，反应温度在28℃，CDP-C转化率可达80％以上(生物化学与生物物理进展，1977，(4)：15-19)。

生物合成的CDP-C反应液中，含有蛋白质，色素，未反应完的磷酸盐，磷酸胆碱，硫酸镁，胞苷酸，以及葡萄糖代谢副产物和胞苷等物质，这使CDP-C的分离纯化带来很多困难。

CDP-C的分离提取先要经过离心去除菌体，调酸、调碱去除蛋白；然后活性炭吸附洗脱；离子交换树脂吸附，分部洗脱等步骤，一般回收率不超过40％，在工业生产中损耗严重(生物化学与生物物理学报，1976，8(3)：199-205；黄颖，医药工业，1985，16(1)：3-5)。另外价格较贵的未反应完的胞苷酸无法回收。

发明内容

本发明需要解决的问题在于公开一种组合柱层析法从生物转化或多酶反应液(以下简称反应液)中分离CDP-C的方法，以克服现有技术的缺陷，并适用于工业规模生产。

本发明的构思是这样的：

本发明采用新型离子交换树脂组合层析法(图1)。1^#阳柱吸附中的色素，蛋白质，胞苷，调节pH；2^#阴柱分离CDP-C和CMP；3^#阴柱浓缩CDP-C溶液。

1^#阳柱可采用大孔酚醛系弱酸树脂(HD-1)。该树脂可吸附大分子物质，如蛋白质等，亦可交换去除阳离子，如钙、镁离子及胞苷，这样可以保护后续分离不受这些物质的干扰，增加后续柱的吸附量。同时还可以吸附去掉大部分的色素，改变反应液的pH为酸性。

2^#阴柱可采用大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂如D301或多孔结构的酚醛缩聚型弱碱性阴树脂如D345或大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂如D315等。由于CDP-C所带负电荷要小于CMP，通过控制pH值可将两者在柱上分离，即CMP吸附到树脂，而CDP-C流出。同时大部分阴离子可被吸附到此柱上。

3^#阴柱可采用强碱凝胶型阴离子交换树脂，如：华东理工大学HZ201或其它厂家生产的201×7，201×8等，粒径在0.5-1.0mm之间。CDP-C可在此柱上得到浓缩，减少后续真空浓缩操作能耗。

本发明的特征是，通过新型阴阳离子交换树脂的有序组合层析，可一次性分离纯化得到高纯度的CDP-C，与老工艺相比，柱分离时间缩短，水耗量降低60％以上，产品容易结晶。

本发明的方法依次包括如下步骤：