[发明专利]纯化L－门冬酰胺酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物蛋白酶药品技术领域，具体涉及一种纯化L-门冬酰胺酶方法。

背景技术

L-门冬酰胺酶(也有如下别名：左旋-门冬酰胺酶、Crasnitin、Colaspase、Asparaginase、ASP、L-ASP、Leunase)是一种抗肿瘤作用的酶抑制剂，能专一性地催化L-门冬酰胺酶水解生成门冬氨酸和氨，使肿瘤细胞缺乏门冬酰胺而影响蛋白质的合成。对不能自身合成而必须依赖宿主提供门冬酰胺的某些肿瘤具有抑制作用。临床上主要用于急性淋巴细胞性白血病，对急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病也有一定疗效。

目前主要从大肠杆菌来制备L-门冬酰胺酶，其主要的生产工艺流程如下：

生产L-门冬酰胺酶的种子菌(如E.coli CPU)经过培养和发酵后，收集菌体；菌体经破壁、盐析离心和过滤后得到过滤液；所述过滤液经过浓缩脱盐后，用酒精沉淀，取其沉淀物并溶解所述沉淀物，而制得DEAE离子交换层析的上样液；所述上样液经过离子交换层析后，再经过浓缩脱盐、除菌和冻干步骤后得到L-门冬酰胺酶的冻干粉。

由于L-门冬酰胺酶是胞内酶，通过溶菌酶破壁提取后，大量细菌内毒素、核酸等杂质同时也被释放出来。在上述传统工艺过程中，采用了DEAE离子交换柱层析进行纯化，但由于目的蛋白和内毒素对离子交换剂的结合能力很接近，很难通过层析达到有效分离，所以这给制备高纯度注射酶制剂带来了很大的困难。

发明内容

本发明的目的在于在保证L-门冬酰胺酶生物活性的前提下，提供一种纯化L-门冬酰胺酶的方法，该方法能有效截留提取过程中释放出的细菌内毒素，制备出符合注射要求的生物酶制剂。

本发明采用的技术方案是：一种纯化L-门冬酰胺酶的方法，生产L-门冬酰胺酶的菌株经过常规处理并经过离子交换层析后，进行疏水层析操作，得到疏水层析流出液，随后对该流出液进行浓缩、除菌、干燥，制得L-门冬酰胺酶。

所述疏水层析操作包括如下步骤：①向经过离子交换柱层析的L-门冬酰胺酶洗脱液中加入盐并搅拌，得疏水层析上样液；②将步骤①所述的上样液流经被平衡液平衡好的疏水层析柱内，并收集上样流出液；③用洗涤液洗涤疏水层析住，并收集洗涤流出液；④将步骤②得到的上样流出液和步骤③得到的洗涤流出液合并，得到疏水层析流出液。

步骤③中所述的洗涤直至洗涤流出液中L-门冬酰胺酶的滴点效价小于500U/ml时结束。

步骤②中所述的平衡液和步骤③中所述的洗涤液相同且均为盐溶液。

所述盐溶液的盐浓度与步骤①中所述的上样液的盐浓度相同。所述盐浓度的范围为4％至8％。

所述盐溶液中的溶质与步骤①中所述的盐相同。

所述的盐为正盐，优选Na₂SO₄或K₂SO₄或(NH₄)₂SO₄，最优选所述的盐为Na₂SO₄。

本发明的积极效果是：(1)疏水层析操作简便、有效，在一定程度提高L-门冬酰胺酶活性的同时，可有效吸附细菌内毒素。(2)采用传统的工艺流程，离子交换层析前和离子交换层析后，内毒素的含量均大于0.25EU/U，而即经过疏水层析后，内毒素的含量小于0.25EU/U。

具体实施方式

(实施例1)

(1)将菌体悬浮于破壁液(含45％蔗糖、10mmolEDTA以及200mg/L溶菌酶)中，在30℃搅拌70min后搅拌下倾入大量水中，加入MnCl₂沉淀菌体碎片和核酸，离心，取上清液即得酶提取液。酶提取液中加入硫酸铵至55％饱和度，离心除去沉淀，上清液中加入硫酸铵至90％饱和度，离心收集沉淀，沉淀物使溶解并透析脱盐。脱盐酶液中加入乙醇至33％(v/v)，离心除去沉淀的杂蛋白，上清液部分加乙醇至40％(v/v)，得沉淀A。沉淀A部分用50mmolLPBS(pH6.4)悬浮，离心后于上清液中加乙醇至45％(v/v)，得沉淀B。沉淀B用5mmolPBS(pH6.4)溶解，经DEAE-纤维素层析，收集显示酶活性组分，即得疏水层析用样品。

(2)疏水层析操作：

①向经过DEAE离子交换层析的L-门冬酰胺酶洗脱液中加入Na₂SO₄，并搅拌，使L-门冬酰胺酶洗脱液中Na₂SO₄的浓度为6％，得到疏水层析上柱液；