[发明专利]人抗HBsAg单链抗体/人抗体轻链恒定区/鱼精蛋白截短体重组基因、编码蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建的一种由人抗HBsAg单链抗体、人抗体轻链恒定区和鱼精蛋白截短体的编码序列组成的重组基因ScFv-Ck-tP，还涉及这种基因编码的ScFv-Ck-tP融合蛋白，以及由该融合蛋白介导的siRNA、siRNA表达组件(siRNA expressioncassettes，SECs)或siRNA表达质粒的靶向输送在抗HBV感染及相关疾病治疗中的应用。

背景技术

由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)所引起的乙型肝炎是一种传播广泛、危害严重的传染性疾病，也是导致慢性肝病，如肝硬化、肝癌的最常见原因。但是目前的抗HBV及其相关疾病的治疗并不让人满意，常用的抗HBV的制剂主要有两大类：α-干扰素和核苷类似物如拉米呋啶(Lamivudine)和阿德福韦(Adefovir)。但是α干扰素的长期有效率仅为30％～40％，而核苷类似物在治疗过程中也存在着抗病毒作用短暂、易于诱发DNA多聚酶突变而形成耐药以及病毒复制水平快速反跳等缺点，因此需要研究和发展高效、特异的抗乙肝病毒药物。同时，由乙肝病人转变来的肝硬化、肝癌的治疗也非常困难，严重威胁人类的健康，也需要开发出高效、特异的治疗药物。    

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默现象。由于它能够高效特异地关闭或降低特定基因的表达，RNA干涉技术已被广泛应用于多种疾病的基因治疗研究中，并取得了显著的结果，在乙型肝炎的治疗研究中更是取得了令人瞩目的结果：体内外实验都证实了针对HBV的siRNA或siRNA表达质粒都可以高效抑制HBV的基因表达和复制。RNA干涉技术的出现为乙型肝炎的抗病毒治疗提供了新的契机，但是，将RNA干涉技术应用于临床还面临许多问题，如siRNA或siRNA表达质粒在体内不稳定、细胞摄取率低、无法靶向输送等。而如何安全有效地将siRNA传递至体内靶部位是RNAi应用过程中最关键的一个问题。

siRNA或siRNA表达质粒的靶向输送将为上述问题的解决提供新的手段，特异性地将siRNA或siRNA表达质粒导入靶细胞，而避免对正常细胞的副作用，及大量应用siRNA或siRNA表达质粒时所引起的非特异性免疫反应。目前关于siRNA靶向输送的研究还处于起步阶段，抗体引导的siRNA的靶向输送是其中最有前景的策略之一。目前基于这一策略的研究报道不多，就所用的抗体分子而言，已有报道的是抗HIV gp120的Fab抗体和抗HER2分子的单链抗体两种，它们分别针对HIV感染细胞表面的胞膜糖蛋白和肿瘤细胞特异性高表达的HER2分子，它们分别与鱼精蛋白形成的融合蛋白可以有效地将siRNA特异性输送到相应的抗原阳性细胞。其中，由Fab抗体融合蛋白介导的siRNA的输送效率约为40％，而单链抗体融合蛋白的输送效率为32％。

噬菌体抗体库技术是近年发展起来的一项分子生物学新技术。它是指利用聚合酶链反应(PCR)扩增出抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)呈现在噬菌体的表面，经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。该技术为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台，并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。目前，已成功地从这种抗体库中筛选出针对多种抗原(如病毒和毒素等)的人源性抗体分子。这些抗体分子对于感染性疾病以及肿瘤的诊断和治疗具有极为重要的实验价值，也为新药的开发和疫苗的研制带来非常广阔的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种将具有抗原识别功能的抗体与具有核酸结合功能的鱼精蛋白或其截短体融合，构建成同时具有抗原和核酸结合活性的融合蛋白，siRNA与这种融合蛋白结合后，可以在抗体的引导下被特异性地输送到靶细胞，并随抗体内化入细胞浆，进入RNAi通路，从而实现对靶基因的高效抑制。