[发明专利]检测细胞内谷胱甘肽的荧光探针及合成方法和用途

说明书

技术领域：

本发明涉及生物检测及临床医学检测技术领域，尤其涉及用于高选择性检测细胞内谷胱甘肽的荧光探针；同时还涉及该荧光探针的合成方法；另外，还涉及该荧光探针的用途。

背景技术：

谷胱甘肽是生物体细胞中含量最高的硫醇，在细胞内抗氧化系统中具有重要的作用(Rahman，I.；MacNee，W.Free Radic.Biol.Med.2000，28，1405-1420；Kamencic，H.；Lyon，A.；Paterson，P.G.；Juurlink，B.H.J.Anal.Biochem.2000，286，35-37.)，因此实时准确的检测细胞中谷胱甘肽的含量具有重要意义。目前已报道的用于检测谷胱甘肽的方法中(Radkowsky，A.E.；Kosower，E.M.J.Am.Chem.Soc.1986，108，4527-4531.；Maeda，H.；Matsuno，H.；Ushida，M.；Katayama，K.；Saeki，K.；Itoh，N.Angew.Chem.，Int.Ed.2005，44，2922-2925.)，荧光法与其他方法相比较在灵敏度、选择性及可应用于活体甚至单个细胞的成像方面具有显著优势。有两项研究已经成功用荧光探针进行了活体中硫醇或谷胱甘肽的检测(Pullela，P.K.；Chiku，T.；Carvan，M.J.；Sem，D.S.Anal.Biochem.2006，352，265-273.；Ahn，Y.-H.；Lee，J.-S.；Chang，Y.-T.J.Am.Chem.Soc.2007，129，4510-4511)，但是它们方法的选择性仍不尽人意。因此，具有高灵敏度、高选择性且能靶向识别谷胱甘肽的新型荧光探针亟待开发。基于2-苯基-1，2-苯并异硒唑酮(Ebselen)类似谷胱甘肽过氧化物酶的催化活性，我们设计合成第一种以罗丹明为母体含有硒氮键的新型荧光探针并且成功实现了活体细胞中谷胱甘肽的实时检测。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种快速响应、高选择性、高灵敏度检测谷胱甘肽的荧光探针，为探讨谷胱甘肽在生物体细胞内抗氧化系统中的重要作用提供良好的辅助手段；目的之二是提供一种工艺简单，性能稳定的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。

本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：

该荧光探针具有下列结构式：

R(取代基)：

本发明的探针分子合成：

其中，R为取代基。

本发明的探针分子与谷胱甘肽的反应机理：

其中，R为取代基。

本发明的目的之二可通过如下技术措施之一来实现：

该合成方法按如下步骤进行：

a.先将150-200毫克硒氢化钾溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再于室温和真空下加入200-250毫克溴代试剂，搅拌，惰性气体保护下依次加入400-500毫克荧光染料、500-600微升三乙胺及150-190毫克碘化亚铜，反应结束后用乙酸乙酯稀释，然后分别依次用去离子水、浓度为1摩尔/升的氢氧化钠溶液洗涤；b.将a步骤的混合物进行分液，得到的有机相先用无水硫酸镁干燥，再将经干燥后荧光探针的粗品用洗脱剂过柱，最后旋蒸除去溶剂，干燥得产品。

本发明的目的之二可通过如下技术措施之二来实现：

该合成方法按如下步骤进行：

a.先向抽真空后通入惰性气体的容器中加入0.1-0.5克镁粉，然后缓慢加入2-3毫升溴代试剂和40-60毫升无水乙醚，通入惰性气体并加入1.2-1.6克黑色硒粉，搅拌，缓慢加入80-100克碎冰，然后滴加10-30毫升浓盐酸。反应混合物用去离子水洗涤后加入80-100毫升甲醇，气体鼓泡反应18-24小时，蒸馏得二硒化物；

b.取5-12毫摩尔a步骤的二硒化物溶于5-12毫升二氯甲烷中，在室温、惰性气体保护和搅拌下缓慢加入1-2毫升溶有1-1.5克磺酰氯的二氯甲烷溶液，经旋蒸除去溶剂，蒸馏得取代苯次硒酰氯；

c.先向通入惰性气体的容器中加入0.2-0.6克荧光染料，然后缓慢加入30-50毫升四氯化碳，搅拌溶解，再加入0.1-0.6毫升三乙胺和b步骤的0.1-0.5克取代苯次硒酰氯，搅拌，反应结束后过滤，乙醇重结晶，得产品。

本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现：