[发明专利]一种迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗

说明书

技术领域

本发明为水产养殖动物病害防治技术，涉及水产养殖细菌性疾病的弱毒疫苗，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)弱毒活疫苗。 

背景技术

迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性致病菌，感染宿主范围广，可以感染多种低等和高等动物。在水产养殖动物中，该菌是鱼类、两栖类、爬行类的重要致病菌。由其引起的爱德华氏菌病是水产养殖鱼类常见的传染病，对养殖动物的健康和水产养殖业危害巨大。在我国，已经从养殖的牛蛙、鳖、鳗鲡、牙鲆、大菱鲆、真鲷等多种动物中分离到致病性的爱德华氏菌。 

由于在生产过程中使用各种抗生素进行疾病的防治，已经在世界各地分离到越来越多的爱德华氏菌抗药性菌株，其中多数菌株呈多重抗药性，不仅使治疗效果下降，而且多种抗药性菌株和抗药质粒的存在增加了环境的压力，对环境造成严重的威胁。早在1981年，国际上就成立了世界《慎用抗生素联盟》，其成员国已达到90多个国家。目前，不少国家已经明令禁止在动物饲料中使用抗生素添加剂。我国加入WTO后，解决抗生素残留等问题已经刻不容缓。为了减少抗生素对环境的影响，通过免疫途径防治爱德华氏菌病发生无疑是一种最佳的方式。人们对迟钝爱德华氏菌的各种疫苗组成(包括灭活菌体细胞苗、脂多糖LPS、去类脂A的多糖、溶血素)和免疫途径(包括注射、浸泡、口服)进行了大量的工作，但这些灭活疫苗或亚单位疫苗的保护效果都不理想，没有达到疾病防控的要求。 

迟缓爱德华氏菌的毒力因子有溶血素、软骨素酶、皮下坏死毒素、过氧化氢酶以及III型分泌系统，这些致病因子参与了细菌的黏附、定殖、侵袭和在动物宿主体内的繁殖和扩散过程。由于迟缓爱德华氏菌可侵入宿主的上皮细胞和吞噬细胞，并在细胞内生长和繁殖。因此作为一种有效的疫苗，只有系统地刺激动物体液和细胞的免疫应答反应才可能达到防治爱德华氏菌病的目的。由于灭活疫苗或亚单位疫苗存在保护抗原不完全、免疫应答反应不全面，尤其是它们主要引起动物的体液免疫应答而不能有效地刺激细胞免疫应答，是疾病防控效果不理想的根本原因；其次是灭活疫苗和亚单位疫苗主要通过注射方式进行鱼类免疫，存在劳动力成本高、给药不方便、容易引起动物应激等副作用。因此到目前为止，还没有可用的迟缓爱德华氏菌疫苗进入市场。 

弱毒活疫苗对动物具有低毒性，同时能够有效地激发动物的体液和细胞免疫应答，为动物提供全面的免疫保护，是目前疫苗开发领域的主要发展方向之一；同时以弱毒活疫苗作为表达异源抗原的载体而进行多价疫苗的开发是国际的前沿和热点。目前，美国专利有利用利福平(rifampicin)培养基对迟缓爱德华氏菌进行多次传代的方法筛选弱毒株作为弱毒活疫苗(United States Patent7067122)，该方法得到的弱毒株遗传背景不清楚，细菌毒力减弱的机理不明确，在使用时容易造成毒力回复，同时难以对疫苗株进行环境监控。利用转座子或基因插入失活技术构建的弱毒疫苗携带有抗生素和其他外源基因片断，施用时容易将抗生素和外源基因片断释放到环境，存在有基因转移或整合到其他病原体或其他生物的潜在危险。因此这些弱毒活疫苗难以通过各国的生物制品安全检察管理机构的审批法规，从而难以实现商品化。 

无标记基因突变技术可以对目的基因进行缺失突变。通过对多个目的  基因的大片段缺失，大大降低了施用时由于毒力回复而带来的环境传播危险。同时弱毒株不带任何外源的抗生素筛选标记和外源基因片段，遗传背景清晰、毒力减弱机理明确，易于区分疫苗株和野生型菌株，便于对疫苗株进行环境监控，提高疫苗的安全性和可控性。同时，以无标记基因突变弱毒突变株作为疫苗载体表达异源抗原制备多价疫苗具有防治多种传染病的潜力，因而是目前国际的研究前沿和热点领域。目前国内外未见利用无标记基因突变技术开发迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗的文献报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种不带外源抗生素抗性标记和外源基因片段的迟缓爱德华氏菌弱毒活疫苗。 

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：迟缓爱德华氏菌毒株野生型菌株LSE40的esrB基因缺失弱毒突变株，所述迟缓爱德华氏菌突变株为MZLSE40esrB，其于2007年6月13日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2087，分类命名：迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda，其突变株MZLSE40esrB中不含外源抗生素筛选标记和外源基因片段。