[发明专利]半滑舌鳎微卫星标记HSTS_yg的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测半滑舌鳎微卫星标记HSTS_yg的技术方法，具体是半滑舌鳎微卫星标记HSTS_yg的检测方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是一种暖温性近海大型底层鱼类，终年生活栖息在我国近每海区，是我国重要的海水养殖新品种。为合理利用和保护野生半滑舌鳎种质资源，一些学者利用同工酶技术、RAPD技术及AFLP技术研究了半滑舌鳎的遗传结构及其遗传多样性(庄志猛等，《海洋水产研究》，2006，2期，10-16页；韩志强等，《中国水产科学》，2007，2期，192-200页)。然而由于同工酶标记、RAPD标记和AFLP标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低，RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏半滑舌鳎微卫星标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取微卫星标记以进行半滑舌鳎遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎DNA分子遗传标记技术，即半滑舌鳎微卫星标记HSTS_yg的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。

本发明的基本构思主要是利用半滑舌鳎RAPD产物中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测半滑舌鳎每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物(微卫星标记HSTS_yg)对半滑舌鳎的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从半滑舌鳎RAPD产物中获取了一个微卫星标记，命名为HSTS_yg，该微卫星标记HSTS_yg可用于半滑舌鳎遗传多样性分析和系谱认证。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取半滑舌鳎血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用半滑舌鳎RAPD产物中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对半滑舌鳎不同地理群或半滑舌鳎群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得半滑舌鳎的遗传多态性图谱。

提取半滑舌鳎基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。

含有微卫星序列的RAPD条带序列为：

1   ggaatcgaat cccgacttcg ttttcttctt caaaccttta ggaacaatcg ctagaacctt

61  ctctctctct ctctcactct ctctcactct ctccttcaca cacacaacca cagagtgtgt

121 gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcatgatgtt ccagtggggg ctcccccagg

181 cggtgtgcct gctgtccctg tccgtgtccc tgctcctggc ctacgacgac ggcgacatcg

241 aggtgaacta cggcgactac agcttcaatg aaatctcacc tgtgttcaca ccagaggctc

301 cggcagaacc agaacccgag cccaccgcca tgccctgcag ctccaaggac ctgaccaagt

361 gggacaagct cttctccatg ttagagaaca gccagatgag ggagaacatg ctgctccagt

421 acgccgatga catcatcaag gtggagatgg ggtcactgcg tgaagaacta accaggtctg

481 tggccccgac cggtggctcc tgtggggccg cggcggagtt ggcctcgcag

其中微卫星核心序列为：agcagcagcagcagcagcagcagcagcagc

HSTS_yg微卫星引物序列为：

正链5’-ATCCCGACTTCGTTTTCT-3’，

负链5’-TCTCCCTCATCTGGCTGT-3’，使用该引物时的退火温度为50℃。