[发明专利]中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因克隆及体外重组表达技术，具体地说是从中华绒鳌蟹cDNA文库中克隆出中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的cDNA全序列并对该序列进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂及人类败血病治疗生产中的应用。

背景技术

细菌内毒素引发败血症休克的防治长期以来难获重要突破，其发病率和死亡率仍呈上升趋势。目前已发现多种具有中和内毒素作用的蛋白质，如多粘菌素B(PMB)、杀菌渗透性增强蛋白(BPI)等，然而这些中和蛋白多需预先或在LPS攻击同时给予才有效。抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)是一种通过特异性识别R型革兰氏阴性菌LPS亚单位脂质A而结合并中和内毒素的蛋白质。动物实验研究表明，在内毒素血症发生时、甚至在内毒素血症的晚期给予ALF，都对实验动物具有良好的保护作用，其保护作用可能与ALF降低脂多糖(LPS)诱导的炎症因子NO的产生并增加抗炎因子IL-10的分泌有关。同时，ALF显示了对某些菌株的生长抑制活性，还可抑制LPS对家兔的致热反应。因此，ALF逐渐成为临床中防治内毒素血症的一条重要途径。但对于该基因的研究却与其重要的应用前景不相符。目前仅在Limulus polyphemus(Tanaka et al，1982)、Litopenaeusvannamei(Gross et al，2001)，Tachypleus tridentatus(Wang et al，2001)，Penaeus monodon(Supungul et al，2002；Supungul et al，2004)，Fenneropenaeus chinensis(Liu et al，2004)和Marsupenaeus japonicus(Nagoshi et al，2006)中获得该基因的同源分子。

中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹，因其营养丰富、味道鲜美而深受人们喜爱，是我国重要的水产养殖品种之一。自20世纪80年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，到2000年全国养殖产量已超过100,000吨，年产值达120-150亿元，已成为水产养殖支柱产业之一(崔朝霞等，2003)。但随着养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大损失。养殖中华绒鳌蟹病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从河蟹自身的免疫防御因子入手，研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。考虑到当前分离到甲壳类的病原菌多为革兰氏阴性菌，抗脂多糖因子作为一种重要的结合LPS的抗菌肽势必会在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，并对其实现原核表达及重组产物的活性鉴定，为进一步研究中华绒鳌蟹防御机制提供基础，并为中华绒鳌蟹的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和饲料添加剂奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因，具有序列表SEQ ID No：1中碱基序列。其是从从中华绒鳌蟹中克隆到抗脂多糖因子的cDNA序列，该序列全长700bp，包括363bp的开放阅读框，编码120个氨基酸，5’非编码区长20bp，3’非编码区长317bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在中华绒鳌蟹免疫防御方面发挥着重要作用。利用pET32a表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中重组表达了该蛋白，表达产物对藤黄微球菌Micrococcus luteus和鳗弧菌Vibrio anguilarum和大肠杆菌TOP10F均具有明显的杀菌活性。其中对于藤黄微球菌的杀菌活性为100％；而对于革兰氏阴性细菌鳗弧菌和大肠杆菌TOP10F的杀菌活性分别是80％和26.42％.

其编码蛋白具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，分子量为13273.42Da，等电点为8.59，其中编码序列的1-25位为信号肽序列，成熟肽分子量为10588.14Da，等电点为8.79，有11个净正电荷，并且具有典型的抗脂多糖因子W(T)CPG(S)WT模体结构。分析该成熟肽序列发现其N-端具有明显的疏水性，呈现β-折叠结构，而C-端亲水性较强，具有典型的α-螺旋结构。

中华绒鳌蟹抗脂多糖因子基因的重组表达产物可作为动物饲料添加剂、食品防腐剂、食品保鲜剂或用于制备治疗人类败血病的药物。