[发明专利]B7－H4在肺癌细胞中的表达与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种B7-H4在肺癌细胞中的表达方法与应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

随着全世界工业化进程的加快，大气环境的恶化，以及吸烟人群的不断增加，20世纪70年代以后肺癌发病率和死亡率在全世界范围内均不断增长，其中非小细胞肺癌占75％，至90年代肺癌已成为人类肿瘤致死的第一杀手。然而，在肺癌发病率不断增长的同时，肺癌治疗效果并未取得突破性进展，肺癌总的治愈率仍低于15％，最主要原因之一是，至今对于晚期肺癌尚无有效的治疗手段。

从免疫学角度对其进行研究和治疗是一条很有希望的途径。现认为肿瘤细胞上缺少CD₈₀和CD₈₆的表达是免疫逃逸的主要原因。然而，负性共刺激分子通过两种方法来诱导T细胞无力：一是诱导抑制性因子表达在效应性免疫细胞上，二是诱导抑制性因子受体表达在肿瘤细胞上。CD₁₅₂和PD-1是众所周知的抑制性因子，阻断抑制性因子的表达是治疗肿瘤的新途径。抗CD₁₅₂抗体已成功应用于黑色素瘤和卵巢癌的治疗中，现也注意到PD-L1在许多癌中表达丰富，因此，负性共刺激分子对于调控免疫反应是非常重要的。B7-H3和B7-H4(B7x，B7S1)是最近发现的B7家族成员，B7-H4的体外试验发现，细胞相关的、非可容性的B7-H4能够抑制T细胞增殖、细胞因子分泌和CTL的诱导，其机制是通过抑制细胞周期中的G₀/G₁相和细胞分裂。可容性的B7-H4可以抑制CD₈+T细胞的增殖和成熟及CTL的活性，认为B7-H4在相对早期阶段抑制T细胞反应。Prasad等认为B7-H4介导的T细胞抑制能够被抗-B7-H4的封闭抗体逆转，引起更强的增殖和IL-2的产生⁽²⁾。在体内，注入抗B7-H4抗体可使自身免疫性脑脊髓膜炎加重，这些结果显示了B7-H4在T细胞反应负性调节中的重要地位。但B7-H4在肿瘤细胞中的表达报道很少。

发明内容

针对B7-H4在抑制肿瘤细胞中研究的不足，本发明提供了B7-H4在肺癌细胞中的表达与应用。

本发明B7-H4在肺癌细胞中的表达方法，步骤如下：

一、细胞株及其培养

人的肺腺癌细胞株：A549、H1299、H23、Wark；人的肺鳞癌细胞株U1752；肺癌大细胞株U1810。培养液为RPMI1640+10％FCS。

二、表达方法

1、肺癌组织常规石蜡包埋、切片；

2、H.E染色及观察；

3、免疫组化检测B7-H4和CD45的表达；

采用连续切片，切片分实验组和空白对照组。免疫组染色采用生物素-链菌卵白素-过氧化物酶方法(Vectastin ABC试剂：VECTOR实验室，INC，.EA.CLSA)。福尔马林固定手术标本，石蜡包埋，切片厚度4um，二甲苯脱蜡，阶梯酒精内水化，900w微波加热2’，进行抗原修复，0.3％的H₂O₂30min阻断内源性抗原，10％正常的血清孵育阻断背景非特异性染色。加入一抗：鼠抗B7-H4(1∶1000稀释)(Nordi Biosite AB)过夜、CD₄₅抗体(1∶100稀释)(Pharmingen，Sam Diego.CA，USA)室温2小时、生物素包被的马抗鼠抗体孵育30分，卵白素连接的过氧化物酶孵育30分种，DAB孵育，苏木素复染。

4、RT-PCR检测肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810中B7-H4的表达：(1)B7-H4引物

        上游引物序列：5’GCAGATCCTCTTCTGGAGCA 3’

        下游引物序列：5’TTAGCATCAGGTAAGGGCTGA 3’

(2)内参照GADPH引物

   上游引物序列：5’AGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTT 3’

   下游引物序列：5’AAGAGCCAGTCTCTGGCCCCAGCCA 3’

(3)逆转录反应：

        细胞总RNA                         4.0μL(1μg)

        dNTP混合物(10Mm)                  2.0μL

        Rnasin Ribonuclease Inhibitor     0.5μL