[发明专利]一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建。

背景技术

抗生素在过去的大半个世纪里极大地延长了人类的寿命，但同时随着抗生素的长期使用，引发了许多抗药性病源微生物。而近年来发展起来的抗菌肽不仅具有广谱抗菌活性和其他一些药用价值，更重要的是它们几乎不会产生耐药性问题。

抗菌肽是一类具有免疫学功能的小分子活性多肽的统称。它们具有抗细菌、真菌、肿瘤、病毒、内毒素和原生动物，刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作用，促进创伤愈合等生物活性。主要存在于昆虫中，现在几乎在所有的物种中都分离到了。

微生物很容易通过基因突变对传统的抗生素产生耐受性，然而，微生物通过基因突变的方式来产生对抗菌肽的耐受性几乎是不可能的。因为其抗菌机制是不同的：抗生素一般是通过抑制细菌的细胞壁、蛋白质或DNA等的合成来发挥作用的，这种作用需要一些特殊受体；而抗菌肽一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔，这样就不需要一些特殊的受体。

1975年瑞典科学家G.Boman等人从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为cecropin。1988年Jaynes J M利用电脑模拟技术以天蚕素(Cecropin)B为蓝本，在不改变二级结构的前提下，合成了一个与天蚕素B类似的抗菌肽——Shiva-1。结果Shiva-1中有约60％的氨基酸被置换，且C末端的酰胺化的甘氨酸也变成去酰胺化的甘氨酸。分子螺旋度Shiva-1为65％，Cecropin为53％。N端一半形成一个结构近于完美的极化的两亲性(amphipathic)α-螺旋，即圆柱形分子的纵轴一边是带正电荷的亲水集团而对称面是疏水区；C端一半为疏水尾。具有两亲性α-螺旋结构的蛋白质与质膜相作用，这使Shiva-1抗菌活性主要依赖于两亲性α-螺旋结构。Shiva-1对革兰氏阳性菌、特别是对革兰氏阴性菌有强大的杀伤力，致死浓度均在μ mol/L级；100μmol/L就可以使疟疾原虫完全致死；对肿瘤细胞的杀伤作用具有选择性，与目前常用的抗癌药物有明显的不同，肿瘤细胞的细胞骨架的缺陷是杀菌肽选择性杀伤作用的位点。Shiva-1的抗菌和疟疾原虫活性远强于天然的天蚕素B，而对感染和未感染的寄主细胞均没有伤害。对癌细胞的作用优于Cecropin B，如对癌细胞钙离子逸出的浓度Shiva-1为50μg/ml，而Cecropin B为150μg/ml。Shiva-1破坏肿瘤细胞的钙离子通道使胞内的钙离子在短时间内大量逸出，也是导致肿瘤细胞损伤不可恢复的原因之一。近年来已有人报道将38个氨基酸的Shiva-1序列N端的两个氨基酸蛋氨酸和脯氨酸去掉，活性和表达量基本不受影响。

Shiva-1已经在大肠杆菌、泡桐、苍蝇之中得到了表达，Cecropin B也已经在毕赤酵母中得到了表达。酵母本生就是很好的高蛋白饲料，通过基因表达技术可实现将具有抗菌活性的肽类随着酵母饲料的喂养直接摄入禽畜体内，增强其免疫力，简单方便；在饲料发酵过程中同步获得，成本降低。用酵母表达抗菌肽易于实现其药用价值的早日市场化。

发明内容

本发明目的在于提供一种用酵母表达抗菌肽易于实现其药用价值的抗菌肽基因及其制备方法和该基因在毕赤酵母载体中的表达质粒的构建。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

抗菌肽基因：由SEQ ID NO.1序列表所示，其中序列由135bp组成，序列前端加Kex2蛋白酶切割位点，后面加终止密码子TAA，两端有EcoR I和Xba I酶切位点。

抗菌肽基因的制备方法：

a.用引物F1和R1互为模板，通过聚合酶链式反应得抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的粗产物；

b.将上述扩增产物在质量百分比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收抗菌肽Shiva-1基因序列的中间段78bp的目的片断；

c.以步骤b)回收得到的产物为模板，用引物F2和R2通过聚合酶链式反应得到抗菌肽Shiva-1基因全序列的粗产物；

d.将步骤c)扩增产物进行质量百分比为15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收抗菌肽Shiva-1基因全序列；

其中：

F1：5′TgTTCAgAAgAATCgACAgAgTTggTAAgCAAATTAAgCAAggTATCC 3′

R1：5′CgACCAAggCgATAgCTggACCggCTCTCAggATACCTTgCTTAATTTg 3′