[发明专利]一种苄嘧磺隆高效降解菌株的筛选及降解活性的鉴定方法

权利要求书

1.一种苄嘧磺隆高效降解菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

1)降解菌的富集驯化：取8～10g接种源置入三角瓶中，加入80～100ml苄嘧磺隆浓度为50～100mg/L的富集培养基和5～10g玻璃珠，于28～30℃，150～180r/min摇床培养条件下振荡培养5～7天，备用；将培养液按体积百分比5～10％的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为100～150mg/L的新的富集培养基中，于28～30℃，150～180r/min条件下振荡培养5～7天，而后将富集培养基中的苄嘧磺隆以50mg/L的浓度梯度递增，按上述接种量和培养过程再转接3～4次，得到富集菌液，待用；

2)分离筛选：在80～100ml苄嘧磺隆浓度为100～150mg/L的选择性无机盐培养基中，按体积百分比5～10％的接种量接种步骤1)中的富集菌液，于28～30℃，180～200r/min条件下振荡培养5～7天；而后将培养液按体积百分比5～10％的接种量接种于苄嘧磺隆浓度为100～150mg/L的新的选择性无机盐培养基中，按上述培养过程再转接3～4次，得到以苄嘧磺隆为唯一碳源的混合菌液，待用；

3)复壮、纯化：将分离筛选所得的混合菌液，稀释10⁶～10⁸倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板上，28～30℃培养2～3天，挑选不同性状的单菌落在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；

4)验证降解菌：将步骤3)中纯化好的菌株在选择性无机盐培养基固体平板上划线，其中选择性培养基内添加苄嘧磺隆至终浓度为100～150mg/L，28～30℃培养3～4天，能够生长的菌株即为能够以苄嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株；

5)鉴定降解菌株的降解活性：利用玉米生测法初筛出高活性的降解菌株，再利用高效液相色谱法确定高效菌株的降解率。

2.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤1)中的富集培养基的组成为：蛋白胨8.0～10.0g，NaCl 0.8～1.0g，KH₂PO₄0.8～1.0g，C₆H₁₂O₆1.0～2.0g，水1000ml，pH＝6.0～7.2。

3.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤2)和4)中的选择性培养基的配方为：NH₄NO₃0.5～1.0g，MgSO₄7H₂O0.5～0.8g，(NH₄)₂SO₄0.5～0.8g，KH₂PO₄0.5～0.8g，NaCl 0.5～0.8g，K₂HPO₄2.0～2.5g，FeCl₃0.005～0.01g，CaCl₂0.01～0.02g，蒸馏水1000ml，pH＝6.0～7.2。

4.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤3)中的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏2.5～5.0g，蛋白胨8.0～10.0g，NaCl 2.5～5.0g，琼脂15.0～20.0g，水1000ml，pH＝7.0～7.2。

5.按权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述采用苄嘧磺隆时用少量甲醇助溶，并在灭菌后加入培养基中。

6.一种按权利要求1所述的苄嘧磺隆高效降解菌株降解活性的鉴定方法，其特征在于：根据玉米生测实验主根长抑制率y——苄嘧磺隆浓度对数x的标准曲线y＝ax+b，初步得出步骤4)中所得的以苄嘧磺隆为唯一碳源的降解菌株的降解活性，筛选出高活性菌株，而后利用高效液相色谱得出高效菌株的精确降解率。

7.按权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于：所述高效液相色谱的色谱条件为：流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为：60～80∶20～40∶0～0.5；流速为0.6～1.0ml/min；检测波长为230～260nm；柱温为28～30℃；进样量为5～10μl。