[发明专利]一种冷冻保存神经干细胞的方法

权利要求书

1.一种冷冻保存神经干细胞的方法，其特征在于如下步聚：

1)确定冷冻保护剂DMSO在室温15℃下，加入到胶原-神经球复合物中的平衡时间为15min；

2)制备20％2×DMSO的冷冻培养液；

3)离心收集“神经球”，准备冷冻保存的“神经球”的直径不要超过100μm，计每10ul体积的神经球数；

4)制备胶原-神经球的混合液，胶原的终浓度为1.75mg/ml，神经球的密度为1X10⁴个/ml；

5)将胶原-神经球的混合液转移到2ml的冻存管中，每管250μl，在37℃，2小时胶原凝固成胶；

6)将制备好的20％2×DMSO的冷冻培养液加入到等体积胶原-神经球凝胶的冻存管中，每管250μl，使DMSO终浓度为10％，室温15℃平衡15分钟；

7)将冻存管转入控速降温冻存盒中，并将冻存盒放置于-85℃冰箱，确保降温速率为-1℃/min，4小时后将冻存管转入-196℃液氮保存；

8)37℃水浴，快速复温，吸出弃掉胶原-神经球凝胶上层的冷冻保护液；加入新鲜培养基500μl，室温平衡5分钟后，吸出弃掉；该步骤重复3次；

9)将步骤8)得到的胶原-神经球凝胶从冻存管中转移到培养板中继续培养，准备进一步的生物学特性的检测。