[发明专利]一种新的植酸酶的克隆和表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种植酸酶基因、该基因编码的植酸酶蛋白，生产该植酸酶的中间型耶尔森菌，一种在宿主细胞(如毕赤酵母)表达植酸酶的方法，以及把该植酸酶作为一种有效成分的饲料添加剂。此外，本发明还提供了一种从目标生物体简单而快速的分离植酸酶基因方法。 

背景技术

植酸磷的含量占动物日粮中总磷50-70％。然而，单胃动物如鸡和猪，缺乏从植酸分子水解释放无机磷的消化酶，以致磷的利用率非常低。没有被消化的植酸磷，通过消化道被排出体外。这导致对土地和水资源的增加的磷生态负担。此外，由于植酸螯合几个必要矿物质，抑制矿物质吸收。总之，在消化道中植酸降低食物的营养价值和饲料的利用率。 

显然，磷(P)是一个必要的生长元素，所以无机磷(如磷酸氢钙，脱氟磷酸三钙)或动物产品(如肉骨粉，鱼粉)被添加到动物饲料中，以满足动物对磷的营养需要。但是这些添加的成分都很昂贵。 

植酸(肌醇六磷酸)是谷类食品或饲料中磷的主要储存形式。植酸酶，是一类水解磷酸单脂键的磷酸酶，它能够从植酸中水解释放无机磷，植酸是P在谷物和饲料中的主要储存形式(E Graf et al.1987)。植酸酶广泛分布于植物、动物和微生物。基于不同来源的植酸酶的特征的分析，微生物植酸酶正越来越多的受到关注。并且，微生物来源的植酸酶作为饲料添加剂，添加到典型的单胃动物日粮中，已经明显的提高了植酸磷的营养利用率(Cromwell，et al，1993)。其结果是降低了动物饲料中无机磷的补充量，同时降低了排泄物中的磷的含量(Kornegay，et al，1996)。随着基因工程技术的发展，一方面，越来越多的微生物菌植酸酶已被分离和/或纯化。例如，“Purification and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena”，(Greiner et al.Arch Biochem Biophys.1997 May 15；341(2)：201-6)，“Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp.DS11”(Kim et al.Enzyme Microb Technol，1998Jan，22(1)，2-7)，“Isolation and characterization of a phytase with improved properties from Citrobacter braakii”(Kim et al.Biotechnol Lett.2003 Aug；25(15)：1231-4)，“Gene cloning，expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus”(Zinin et al.FEMS Microbiol Lett.2004 Jul 15；236(2)：283-90)；另一方面，通过定点突变或基因改组，常规植酸酶的性能改良也取得了一定进展。例如；“植酸酶phyA-m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性”(陈惠等，生物工程学报，2005年11月，21卷6期，983-987)，或者“Site-directed mutagenesis of Escherichia coliphytase”(US patent 6,841,370，Lei XG，2005)。这些取得的成果使得植酸酶的生产成本有了很大程度的降低。因为这些优势，一些已知的植酸酶在饲料工业上得到广泛应用。 

但是，在这些已广泛使用的植酸酶中，仍然存在着一些缺陷。因为这些植酸酶作为饲添加剂，并不能发挥它的理想作用。例如，大部分植酸酶在饲料制粒加工的过程中就已经高温变性失活了，所以在肠道中不能发挥降解植酸的作用。其原因因酶不同而不同。主要是由于，这些酶的稳定性比较差(pH稳定性、热稳定性、抗蛋白酶降解的稳定性以及在储存运输过程中的稳定性)和在胃肠道环境中活性比较低的缘故。 

由于目前使用的植酸酶存在的这些缺陷，因此，人们希望能够找到这样一种新的植酸酶：其具有非常好的稳定性，在动物胃肠道中有非常高的活性，并且该植酸酶还能够通过发酵技术大量生产，这样可以使其成本大幅度的降低，从而能够进一步推广该植酸酶的使用。