[发明专利]反应容器及DNA的扩增反应方法

说明书

技术领域

本发明涉及适于生物体反应的一次性容器。例如，涉及一次性反应容器，其可适用于，采集含有来自人体的微量DNA的样品，使其进行PCR扩增并检查其单核苷酸多态性。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)，表示在DNA序列中单碱基被其他的碱基置换，由于该单碱基的不同，产生个人的个体差异，即易患病度、所开药剂的种类和效果以及副作用等上的差异。因此，为在遗传基因水平上对其体质进行检查并且对每种体质决定治疗方针和预防方针，此SNP的检查受到关注。

作为使用于该检查的DNA，例如，利用从人体采集的血液等样品中所包含的DNA，但是为了使采集的血液等样品少量即可，并有效率地进行检查，通过使采集的样品中的DNA扩增且检查扩增后的DNA，来检知所述SNP。

对于扩增样品中所包含的微量DNA的方法来说，已知有各种方法，其中PCR法作为代表性的方法被公知。该方法，将样品中的双链DNA的变性阶段(生成单链DNA)、退火阶段(将被称为引物的寡聚核苷酸和单链DNA的一部分进行杂交)、以及延伸阶段(以所述引物作为起点使核苷酸延伸)所构成的三个阶段作为一个循环、并且反复进行该循环使样品中的DNA扩增。在理论上，循环数作为n，则可扩增至2ⁿ倍。变性阶段在80～100℃进行，退火阶段在50～60℃进行，而延伸阶段在60～80℃进行。一个循环所需要的时间最多为10分钟左右，但是为了反复进行该循环扩增必要量的DNA，则也有花费数小时的情况。

另外，扩增获得DNA被用于此DNA中所包含的SNP的检查阶段(分型阶段)。分型方法有多种，其中侵入法作为代表性的方法被例举。在该方法中，使用两种非荧光标记寡聚核苷酸(等位基因探针(Allele probe)、侵入探针(Invader probe))、一种荧光标记寡聚核苷酸(FRET探针)以及对DNA结构特异性的核酸内切酶(裂解酶)。等位基因探针为5’端具有与模版DNA的序列不相关的序列(标签(フラツプ))、3’端具有相对模版DNA特异性的互补序列的寡聚核苷酸，其互补序列的5’端末端成为SNP部分。另一方面，侵入探针被设计，以从所述SNP部分开始与模版DNA的3’端互补性地结合。另外，FRET探针为具有荧光标记的寡聚核苷酸，在其5’末端具有荧光标记(报告基团(Reporter))，在其上游结合猝灭基团(Quencher)。并且，从报告基团开始3’端的部分进行自体杂交并构成双链，从该双链开始在3’末端侧具有与等位基因探针的标签呈互补序列的单链的部分。另外，裂解酶为识别核苷酸的三层重叠的部分、切断三层重叠的核苷酸的3’端并使其游离的酶。

另外，在该侵入法中，首先，在将检查对象的模版DNA和等位基因探针进行杂交后时，侵入探针的3’末端侵入SNP部分。因此，在该SNP部分，模版DNA、等位基因探针以及侵入探针相重叠形成三层结构。裂解酶识别该SNP部分的结构，使等位基因探针的标签切断或游离。然后，来自等位基因探针的所述游离标签与FRET探针进行杂交。通过杂交，在自体杂交的双链和来自等位基因探针的所述游离标签的交点形成三层结构，裂解酶再次识别此结构并切断FRET探针的报告基团，而从猝灭基团上被放开。然后，通过利用激发光进行照射，被切断游离的报告基团的荧光标记进行荧光显色。如果SNP部分的碱基与等位基因探针不相配，则不切断或游离来自等位基因探针的标签，因而，由于荧光发光率非常低，通过检出该荧光强度的差，可以检查SNP。另外，一般利用紫外光或者可视光作为激发光。

上述的DNA的检查技术提出了以下方法(JP特开平05-317030号公报)：即，由于污染(contamination)而使得其检查精度降低，因而使用一次性反应容器，在基板上设置多个凹部以分别作为收容室、反应室及检查室，在收容室内收容必要的试剂，同时在反应室使用该试剂等进行PCR扩增反应，在检查室进行分型(typing)反应。通过该方法，由于可在一次性反应容器中完成单一的检查对象的检查，可防止污染而进行正确地检查。

专利文献1：JP特开平05-317030号公报

发明内容

然而，如前所述，PCR扩增反应需要在80～100℃的范围反复进行热循环，并且为了能够获得必要量的DNA需花费数小时。在这种进行长时间加热的情况下，DNA和试剂蒸发，反而使其减量，从而出现不能获得必要量的DNA的情况。

因此，本发明的目的在于提供一种防止这些DNA和试剂蒸发且能够获得必要量的DNA的一次性反应容器和利用该反应容器的扩增反应方法。