[发明专利]用可逆2’－修饰的核苷酸进行的序列测定和基因分型

权利要求书

1.一种测定至少部分模板核酸序列的方法，该方法包括：

(a)将至少一种模板核酸与至少一种聚合酶、至少一种在糖部分 的2’位包含磷酸基作为封闭基的2′-修饰的可逆终止核苷酸、至少一 个与至少一个模板核酸亚序列互补的引物核酸温育，其中聚合酶延伸 引物核酸产生至少一个将2′-修饰的可逆终止核苷酸掺入其3′-末端的 引物延伸产物；

(b)脱除引物延伸产物3′-末端2′-修饰的可逆终止核苷酸的2′位 上的封闭基；和

(c)在(b)之前和/或其过程中，确定引物延伸产物中的2′-修饰的 可逆终止核苷酸，其中由已确定的2′-修饰的可逆终止核苷酸可确定 至少一部分模板核酸碱基序列，从而测定至少一部分模板核酸序列。

2.权利要求1的方法，其中(b)包括将引物延伸产物与可脱除2′ 位磷酸基的活性物质温育。

3.权利要求2的方法，其中可脱除2’位磷酸基的活性物质为磷 酸酶。

4.权利要求2的方法，其中可脱除2’位磷酸基的活性物质为核 酸外切酶III。

5.权利要求2的方法，其中可脱除2’位磷酸基的活性物质为核 酸内切酶IV。

6.权利要求2的方法，其中可脱除2’位磷酸基的活性物质为多 核苷酸激酶。

7.权利要求2的方法，其中可脱除2’位磷酸基的活性物质为磷 酸二酯酶或磷酸二酯酶与磷酸酶的组合物。

8.权利要求1的方法，其中2′修饰的可逆终止核苷酸选自：

X＝O、NH、S

Y＝O、S、Se、BH3

Z＝H、染料

R1、R2＝独立的OH、烷基、芳基、

烷氧基、烷氨基、硫代烷基、(OPO2)nOH、

染料、猝灭剂、接头+标记。

9.权利要求1的方法，其中用至少一个标记部分标记2′-修饰的 可逆终止核苷酸。

10.权利要求9的方法，其中标记部分包括荧光染料、发光分子 或放射性同位素。

11.权利要求10的方法，其中的标记部分为荧光染料。

12.权利要求9的方法，其中标记部分通过可裂解的接头与2′-修 饰的可逆终止核苷酸的碱基相连接，该方法进一步包括断裂接头的步 骤。

13.权利要求9的方法，其中标记部分与2′-修饰的可逆终止核苷 酸的糖残基连接。

14.权利要求9的方法，其中标记部分与2′-修饰的可逆终止核苷 酸2’位的磷酸基连接。

15.权利要求9的方法，其中2′-修饰的可逆终止核苷酸与包含供 体和受体的两个标记部分连接。

16.权利要求15的方法，其中供体和受体为报告分子和猝灭 对。

17.权利要求15的方法，其中两个标记部分能够进行荧光共振 能量传递。

18.权利要求16的方法，其中猝灭部分与2′-修饰的可逆终止核 苷酸的碱基相连，报告分子部分与磷酸基相连，其前提为该磷酸基不 是2′-修饰的可逆终止核苷酸的α-磷酸基。

19.权利要求18的方法，其中的磷酸基是γ-磷酸基。

20.权利要求18的方法，其中磷酸基是2′-修饰的可逆终止核苷 酸2’位的磷酸基。

21.权利要求15的方法，其中一个标记部分与2′-修饰的可逆终 止核苷酸2’位的磷酸基相连，第二个标记部分与第二个磷酸基相连。

22.权利要求21的方法，其中第二个磷酸基是γ-磷酸基。

23.权利要求1的方法，其中至少一个2′-修饰的可逆终止核苷酸 包括四种不同的2′-修饰的可逆终止核苷酸，每种2′-修饰的可逆终止 核苷酸具有不同的碱基，标有不同的标记部分。