[发明专利]多核苷酸标记试剂

说明书

本发明涉及核苷酸化学领域的新物质及其制备方法。这些物质是 所谓的磷酸酯模拟物，其中羟基被相应的模拟物置换。

具体而言，本发明涉及用于制备一类新的修饰寡核苷酸的标记试 剂。

技术现状

本领域已知多种合成具有修饰的磷酸酯部分的核苷酸或寡核苷 酸的方法。

通常，利用亚磷酰胺化学在固相上制备合成的(脱氧)寡核苷酸。 具有确定尺寸的孔的玻璃珠(在下文中缩写为CPG＝定孔玻璃)通常用 作所述固相。通过可裂解基团将第一单体连接于所述载体，从而在完 成固相合成后，可以裂解掉游离的寡核苷酸。此外，第一单体含有保 护羟基，在这种情况下，二甲氧基三苯甲基(DMT)通常用作保护基。 可以通过酸处理除去保护基。然后，在5′端，将也具有DMT保护基 的(脱氧)核糖核苷的3′亚磷酰胺衍生物连续地偶联到在循环过程中在 各种情况的DMT保护基中释放的反应基。或者，3′二甲氧基三苯甲基 -保护的5′亚磷酰胺用于反相寡核苷酸合成。H-膦酸酯方案还特别用于 在磷酸酯主链上引入修饰，例如，以制备放射性同位素标记的硫代磷 酸酯。制备修饰或标记的寡核苷酸的多种方案也是已知的：根据现有技 术使用三功能载体物质制备在3′端标记的寡核苷酸(US 5,290,925，US 5,401,837)。通常，使用通过C3-12接头将标记基团结合于亚磷酰胺的 标记的亚磷酰胺，制备在5′端标记的寡核苷酸(US 4,997,928，US 5,231,191)。此外，可以将修饰在各碱基上引入寡核苷酸(US 5,241,060， US 5,260,433，US 5,668,266)，或者通过引入内部非核苷接头来引入修 饰(US 5,656,744，US 6,130,323)。

或者，可以通过硫代磷酸酯的合成后标记(Hodges，R.R.等， Biochemistry 28(1989)261-7)或通过后标记官能化的亚磷酰胺 (Agrawal，S.，Methods in Mol.Biology 26(1994)Protocols for Oligonucleotide Conjugates，第3章，Humana Press，Totowa，NJ)来标记 核苷间磷酸酯。然而，这些方法由于亚磷酰胺和磷酸硫酯的不稳定性 尚未被接受。

从现有技术也已经知道，在寡核苷酸的核苷间磷酸酯残基上可以 引入修饰。最突出的例子是硫代磷酸酯(Burgers，P.M.，和Eckstein，F.， Biochemistry 18，(1979)592-6)、甲基膦酸酯(Miller，P.S.，等， Biochemistry 18(1979)5134-43)或硼烷合(borano)磷酸酯(WO 91/08213)。为了制备甲基膦酸酯寡核苷酸，必须合成特殊单体。与此 相反，惯用的亚磷酰胺或H-膦酸酯可用于合成硫代磷酸酯和硼烷合磷 酸酯，在这种情况下，通过使用与H-膦酸酯或膦酸三酯反应的特殊试 剂，可以在寡核苷酸合成过程中或之后直接地引入硼烷合或硫代修 饰。虽然所有这些方法都产生修饰寡核苷酸，但是用于此的合成化学 的条件不允许在寡核苷酸合成过程中在寡核苷酸链的磷酸酯骨架上 直接地引入在所述方法中可检测的标记或官能团。

Baschang，G.和Kvita，V.，“Angewandte Chemie”85(1)(1973)43-44 描述了核苷酸磷酸三酯与叠氮化物(例如甲磺酰叠氮化物)反应制备三 烷基(芳基)亚氨基磷酸脂，然而其不稳定并分解。

Nielsen，J.和Caruthers，M.H.，J.Am.Chem.Soc.110(1988) 6275-6276描述了在烷基叠氮的存在下提供有2-氰基-1，1-二甲基乙基 保护基的脱氧核苷亚磷酸酯的反应。此外，作者提议该原则适于制备 在磷酸酯残基上修饰的核苷酸，但没有说明利用所披露的方法制备的 何种类型的修饰可以具有特殊的优点。特别地，作者提议引入烷基残 基。

WO 89/09221披露了N-烷基亚磷酰胺、更精确地说在至少一个磷 酸酯残基上被N-烷基取代的寡核苷酸，其通过在合适的烷基胺的存在 下用碘氧化核苷亚磷酸酯(具有保护基)进行制备。

WO 03/02587披露了修饰的寡核苷酸的制备，其中通过氨基化将 H-磷酸酯改变为氨基磷酸酯。