[发明专利]单性生殖激活人类卵母细胞用于产生人类胚胎干细胞

权利要求书

1.产生人干细胞的方法，其包括：

a)单性生殖激活人卵母细胞，其中所述激活包括：i)在高O₂张力下使所述卵母细胞与离子载体接触，和ii)在低O₂张力下使所述卵母细胞与丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂接触；

b)在低O₂张力下培育步骤(a)所述的激活卵母细胞，直到胚泡形成；

c)将所述胚泡转移到饲养细胞层，并在高O₂张力下培养所述转移胚泡；

d)将内细胞团(ICM)从步骤(c)所述胚泡的滋养外胚层机械地分离出来；和

e)在饲养细胞层上培养步骤(d)所述的ICM的细胞，其中所述培养步骤(e)在高O₂张力下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述低O₂张力通过在包含大约2％ O₂到大约5％ O₂的O₂浓度的气体混合物环境中孵育而维持。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述气体混合物环境进一步包括大约5％ CO₂和大约90％ N₂到93％ N₂。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述高O₂张力通过在包含大约5％ CO₂和大约20％ O₂的气体混合物环境中孵育而维持。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子载体选自离子霉素和A23187。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂选自星形孢菌素、2-氨基嘌呤、鞘氨醇、和6-二甲氨基嘌呤(DMAP)。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述激活、分离和培养步骤在的确定成分培养基条件下进行，用于治疗应用。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养基包括人脐带血清。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包括大约10％的人脐带血清。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述饲养细胞层包括人成纤维细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述成纤维细胞是出生后人皮肤成纤维细胞。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述饲养细胞被抗生素失活。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗生素是丝裂霉素C。

14.分离的干细胞，其由权利要求1所述的方法制备。

15.激活人中期II卵母细胞的方法，其包括：

a)在体外受精(IVF)培养基中孵育人中期II卵母细胞；

b)在包含离子载体的IVF培养基中孵育步骤(a)所述的细胞；

c)在包含丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂的IVF培养基中孵育步骤(b)所述的细胞；和

d)在新鲜的IVF培养基中孵育步骤(c)所述的细胞，直到胚泡形成，

其中所述孵育步骤(a)和(b)在高O₂张力下进行，并且其中从步骤(d)所述的胚泡得到的内细胞团(ICM)产生可培养的干细胞。

16.根据权利要求15所述的方法，其中用于孵育步骤(c)和(d)的所述O₂张力通过在包含大约2％ O₂到5％ O₂的O₂浓度的气体混合物环境中培育所述细胞而维持。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述气体混合物环境进一步包括大约5％CO₂和大约90％ N₂到93％ N₂。

18.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括用透明质酸酶孵育所述卵母细胞。

19.根据权利要求15所述的方法，其中孵育步骤(a)在大约37℃下进行大约2小时。

20.根据权利要求15所述的方法，其中孵育步骤(b)在大约37℃下进行大约5分钟。