[发明专利]具有降低的O－糖基化的糖蛋白的产生

权利要求书

1.一种生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括： 

(a)              提供与可诱导启动子可操作地连接的、编码蛋白质的核酸；

(b)             将所述核酸导入酵母宿主细胞或丝状真菌宿主细胞中来提供所述宿主细胞的培养物；

(c)              所述培养物生长足够的时间以提供大量的具有所述核酸的所述宿主细胞，之后用Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物；和 

(d)             所述培养物与所述启动子的诱导物接触来诱导所述蛋白质的表达一定时间，之后或同时用所述Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物，

(e)              分离在存在所述一种或多种抑制物的情况下所述宿主细胞产生的糖蛋白来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种抑制物是苯亚甲基噻唑烷二酮。

3.权利要求2的方法，其中所述一种或多种抑制物选自由5-[[3,4-二(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[[3-(1-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸构成的组。

4.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是Pichia pastoris或Saccharomyces cerevisiae。

5.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞已经被遗传修饰来产生具有主要N-聚糖糖形式的糖蛋白，所述主要N-聚糖糖形式的糖蛋白选自Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂。

6.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞已经被遗传修饰来产生糖蛋白，在所述糖蛋白中N-糖基化模式是像人类的或人源化的。

7.权利要求1的方法，其中以至少100 mg/升培养基的产量生产所述糖蛋白。

8.一种生产具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质的方法，包括： 

(a) 提供与可诱导启动子可操作连接的、编码蛋白质的核酸；

(b) 将所述核酸导入酵母宿主细胞或丝状真菌宿主细胞中，并使含有所述核酸的宿主细胞来产生所述宿主细胞的培养物生长足够的时间以提供大量的具有所述核酸的所述宿主细胞，之后用所述Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物接触所述培养物；

(c) 用Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物和任选地一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶接触所述培养物；以及 

(d) 分离在存在所述一种或多种抑制物和所述一种或多种α-1,2-甘露糖苷酶的情况下所述宿主细胞产生的糖蛋白来产生具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质。

9.权利要求8的方法，其中所述培养物在存在Pmt-介导的O-连接的糖基化的一种或多种抑制物的情况下生长。