[发明专利]肝病的诊断方法和用于筛选治疗这种疾病的分子的方法

说明书

本申请的目的是肝病的诊断方法。其另一个目的是筛选用于治疗这 种疾病的分子的方法。

载脂蛋白A4(Apo A4)是一种大量流通的载脂蛋白。这种蛋白质 的表达在啮齿目动物的下丘脑、小肠和肝脏中被证实。在小鼠血浆中存 在的Apo A4的大部分被认为是肠源的(Wu等人，JBC 254，7316-7322 1979)。

在人类中，Elshourbagy(JBC 262 1987)叙述Apo A4的合成被限 制在小肠中。

Apo A4具有多种功能。它借助于不同的机理调节脂类的运输和代 谢，比如活化自肝组织流出的胆固醇和刺激脂蛋白脂肪酶的活性(Stan 等人，Biochim Biophys Acta，1631 2003，177-187)。

Apo A4还已知是饱胀感因子。

肝病成为公众健康的重大问题。因此借助于特定的敏感测定方法在 尽可能早的时期诊断各种肝病是非常必要的。

本申请人意外地发现，Apo A4在人的肝脏中被表达，在肝病时编 码Apo A4的基因的肝脏表达水平明显地增高。

本发明的目的是肝病的检测、诊断或预测的方法，该方法包括测量 在肝细胞或肝组织中，或者在这些细胞和组织的提取物中，或者在血液 及其衍生物中Apo A4的表达。

本发明的另一个目的是不仅测量在该细胞或肝组织中Apo A4的表 达，而且还测量在存在肝源Apo A4的血液中的表达。

一种方法可包括如下的步骤：

-分离肝细胞、肝组织或者这些细胞和组织的提取物，或者血液或 其衍生物，以及

-测量Apo A4的表达。

通过溶解肝细胞和肝组织就能够得到这种提取物。肝病应该理解为 对肝组织和肝细胞具有影响的各种疾病，可以是慢性的，也可以是病原 性的(酒精性、病毒性、毒性、饮食性、环境性等)。

更具体说，本发明的目的是对脂肪肝、肝癌发生、肝硬化、病毒性 肝炎、肝细胞功能不足、胆汁郁积、门静脉高血压、脂肪变性和脂肪肝、 肝脏静脉和动脉疾病、纤维化、肥胖症和代谢综合症的检测、诊断或预 测的方法。

血液衍生物应当理解为通过物理处理(比如离心)或生物处理(例 如，凝结)或化学或其它能够得到这些衍生物的处理方法得到的来源于 血液的各种细胞或非细胞部分。

这样的衍生物优选是血浆和血清。

按照本发明的一个实施方式，所述方法包括测量从在希望诊断或预 测肝病的个体的肝细胞或肝组织中编码Apo A4的基因转录的信使RNA (mRNA)的量。

将所述哺乳动物的肝细胞或肝组织，或者在其血液或其衍生物中的 细胞提取，并且用本领域技术人员已知的方法进行处理，特别是为了避 免信使RNA和蛋白质降解，然后测量由编码Apo A4的基因转录的信使 RNA的量。

按照特别有利的方式，按照所谓定量聚合酶链式反应即QPCR方法， 通过扩增来测量转录的信使RNA的量。

按照这种技术，提取全部RNA并将其提纯，借助于反向转录酶， 将在提取液中所含的信使RNA在第一时间被转化为互补DNAs (cDNAs)。

在本发明中优选使用的聚合酶是Taq聚合酶，但也可以是具有聚合 酶活性并可在PCR操作条件下可以使用的各种其它酶。由于其性能，这 种酶可使在每一个合成周期中初始的DNA的量倍增。

对由生物试样中所含的mRNA衍生得到的cDNA的分析是通过定 量PCR实时进行的。按照基本上包括周期重复的方法，借助于Apo A4 序列的特定引物和探针对cDNA进行扩增，该周期包括如下步骤：

-通过对由试样制备的cDNA进行加热来分离待扩增的链，

-对探针和一对正义引物和反义引物进行杂交，以及

-通过用聚合酶延长来进行DNA链的新的合成。

正义引物和反义引物有利地含有至少15个核苷酸，并与相应于SEQ ID N°13(基因数据库No.NM000482)的人的Apo A4序列或与其互补序 列具有至少80％，优选90％，和更优选95％的同一性。