[发明专利]新的内切核糖核酸酶

说明书

技术领域

本发明涉及新的序列特异性内切核糖核酸酶，其用于遗传工程领域。

背景技术

已报道，有几种原核质粒具有杀伤其中质粒已掉落的宿主的分离后杀伤(post-segregation killing)(PSK)功能以将质粒维持在宿主中。这样的质粒具有毒素-抗毒素基因。抗毒素与细胞中的毒素结合以使得毒素失活。该抗毒素容易被蛋白酶降解。蛋白酶使抗毒素降解导致稳定毒素的激活(非专利文献1)。这样的毒素-抗毒素基因也存在于大多数原核生物的染色体中。它们对各种应激起反应并且在程序性细胞死亡中发挥作用。尽管这些毒素的功能尚未完全证实，但是已有暗示CcdB和ParE可能控制复制靶向DNA促旋酶，且RelE和Doc可能控制转录(非专利文献1和2)。

大肠杆菌(Escherichia coli)中存在至少五种毒素RelE、ChpAK(MazF)、ChpBK、YoeB和YafQ(非专利文献2)。Christensen等人已报道，RelE是一种识别特定三核苷酸密码子的以核糖体依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶(非专利文献3和4)。此外，Christensen等人已报道，ChpAK、ChpBK和YoeB也是以核糖体和密码子依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶(非专利文献5和6)。

Inouye等人已经证明，MazF(ChpAK)是一种识别特定核苷酸ACA的以核糖体非依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶(非专利文献7和8)。Munoz-Gomez等人已报道，mazF对RNA的切割特异于NAC(非专利文献9)。Inouye等人已经证明，质粒R100中的PemK是一种识别特定核苷酸UAH(H是C、A或U)以切割mRNA的内切核糖核酸酶(专利文献1，非专利文献10)。如上所述，已提示，RelE或PemK家族的毒素可能是以核苷酸特异性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶。具体地，PemK家族的毒素可能是识别特定核苷酸的以核糖体非依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶。PemK家族的许多毒素存 在于原核生物中，并且对它们序列的比较已经有了广泛的研究(非专利文献1和11)。

Anantharaman等人已经通过基于毒素的遗传信息和已完成基因组分析的生物的遗传信息来进行基因相邻分析，对毒素作了系统发生分类，并从功能未知的蛋白预测了毒素样蛋白(非专利文献12)。此外，通过分析已经提示，不仅RelE和PemK，而且Doc家族的蛋白质以及具有PIN结构域的蛋白质都具有核糖核酸酶活性。在堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)中已经发现了一种PemK家族毒素(非专利文献13)。

至于以序列特异性方式切割核酸的酶，已经发现并在遗传工程领域中广泛使用了许多切割双链DNA的限制酶。至于以序列特异性方式切割单链RNA的酶，已经发现了在G核苷酸处特异性切割的核糖核酸酶T1，并已将其用于遗传工程(非专利文献14)。识别单链RNA中多个核苷酸并对其进行特异性切割的酶的数目仍然很少。在遗传工程领域需要开发这样的内切核糖核酸酶。如果发现了特异性识别并切割三核苷酸(如同MazF)或多于三核苷酸的序列的内切核糖核酸酶，则认为该内切核糖核酸酶将是遗传工程领域中有用的酶。

专利文献1：WO 2004/113498

非专利文献1：J.Bacteriol.，182：561-572(2000)

非专利文献2：Science，301：1496-1499(2003)

非专利文献3：Molecular Microbiol.，48：1389-1400(2003)

非专利文献4：Cell，122：131-140(2003)

非专利文献5：J.Mol.Biol.，332：809-819(2003)

非专利文献6：Molecular Microbiol.，51：1705-1717(2004)

非专利文献7：Molecular Cell，12：913-920(2003)

非专利文献8：J.Biol.Chem.，280：3143-3150(2005)

非专利文献9：FEBS Letters，567：316-320(2004)

非专利文献10：J.Biol.Chem.，279：20678-20684(2004)

非专利文献11：J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，1：295-302(1999)

非专利文献12：Genome Biology，4：R81(2003)