[发明专利]新的酯酶和它们在丁炔醇酯的动力学拆分方法中的用途

说明书

发明领域

本发明一般涉及具有酯酶活性的酶和它们在丁炔醇酯(butinolester)的动力学拆分方法中的用途。

发明背景

定向进化在过去的十年里已经出现作为一种强有力的改进生物催化剂的方法^[1]。例如，D-乙内酰脲酶的对映选择性可以被逆转从而导致了用于合成光学纯L-氨基酸的大大改良的方法^[2]。

Reetz和Jaeger能够增加来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的脂肪酶对手性羧酸(2-甲基癸酸)的对映选择性，首次从E＝1.1(野生型)增加到E＝11^[3]。利用一系列分子生物学方法，他们最终能够鉴定出一种具有实际上有用的选择性(E＝51)的变体^[4]。类似地，我们通过结合易错PCR和饱和诱变方法，能够将来自于荧光假单孢菌(Ps.Fluorescens)的酯酶(PFE)针对3-苯基丁酸的对映选择性从E＝3.5增加到E＝12^[5]。

成功的定向进化实验强烈的依赖于几个方面：对想要的显示出增强的对映选择性的变体的鉴定很强地依赖于所使用的高通量筛选方法，因为使用替代底物(即，对硝基苯酯)所确定的选择性会显著的不同于真实底物(即，甲酯)，这会导致假阳性变体。此外，认为突变的随机引入不会显著的影响生物催化剂的其它特性和它在微生物宿主中的产生。另外一个方面是产生的突变的位置。定向进化实验常常导致一类变体，在这类变体中，有效的突变远离活性位点区域，尽管它们影响底物的特异性或对映选择性，并且更近的突变是否更好的问题也在文献中提出^[6]。对1a乙酸酯的水解酶催化的拆分非常具有挑战性，因为这个仲醇的取代基大小只有很小的差异。根据“Kazlauskas规则”^[7]，它仅仅被脂肪酶或酯酶以低至中等的E值转化。

(R)-醇可以用于合成(-)-akolactone A——细胞毒性丁内酯(cyctotoxic butanolide)^[8]，pancrastatin——一种抗肿瘤生物碱^[9]，手性的基于环丙烷的配体^[10]以及用于4-羟基-2-戊炔酸(R)-苯甲酯((R)-benzyl4-hydroxyl-2-pentynoate)的大规模生产^[11]。1a的两种纯的对映异构体用于通过Johnson重排制备对映的和非对映纯的烯丙基硼酯(allylboronicester)，产生了对映纯的高烯丙醇^[12]。其它的例子包括从α-氨基丙二烯合成3-溴代-吡咯啉^[13]，旋光的二环配体用于合成HIV蛋白酶抑制剂^[14]或α_vβ₃拮抗物(骨质疏松)的重要中间体^[15]。应用(S)-醇的一个例子是手性环状碳酸酯的制备^[16]。

之前，我们研究了用于1b的动力学拆分的＞100种水解酶^[17]，最好的酶是在大肠杆菌(E.coli)中重组表达的来自于荧光假单孢菌的酯酶(PFE)^[18](SEQ ID NO：1)。但是反应时间过程的详细分析发现，对映选择性在乙酸酯的水解过程中显著下降(表1)和观察到完全的转化从而导致外消旋的醇1a。在专利中描述了来源于荚壳假单孢菌(Pseudomonas glumae)的酯酶的类似效果^[19]。在相应的丁酸酯水解中，最初的值是E～30，但是后来也在更高的转化中下降，使得高产率的拆分不切实际。只有Nakamura和同事报道了可接受的对映选择性，但是这种小规模的拆分需要使用大量的脂肪酶Amano AH和非常长的反应时间(2d)^[20]。备选的不对称的酶促酮还原受到很低的对映体过量阻碍，如来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的NADPH依赖的醇脱氢酶提供(R)-醇的具有60％ee或NADH依赖的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)羰基还原酶产生的(S)-醇具有49％ee显示的那样^[21]。此外，3-丁炔-2-酮很不稳定，具有热分解的高风险性，限制了大规模的拆分，即使可以利用高选择性的还原酶。

发明目的

本发明的目的是为光学纯的3-丁炔-2-醇的制备提供高度有效的水解酶，其没有现有技术中酶的缺点。

发明详述