[发明专利]一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽药物领域，更具体的，本发明涉及大肠杆菌外分泌表达生产溶葡萄球菌酶的方法。

背景技术

溶葡萄球菌酶于1964年由Schindler和Schuhard首次在Staphylococcus simulans菌的培养物中发现(美国专利，专利号为3,278,378；1966年)，分子量为27kDa，含246个氨基酸。其作用机制是裂解葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽键桥，进而破坏细胞壁的完整性并溶解菌体，是一种肽链内切酶。在80年代国内外就已经通过分子克隆方法将溶葡萄球菌酶的基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及球形芽孢杆菌等细菌中进行表达。由于其独特的杀菌机制，因此在较低的药物浓度下能很快地裂解葡萄球菌细胞壁，抗菌作用快、抗菌活性强、不易诱导耐药株、抗菌谱专一。目前国内外已经能大规模生产高纯度的重组溶葡萄球菌酶，且已商品化，较为广泛地用于细菌学、消毒学、酶学研究，以及临床抗菌治疗等方面。

由于Staphylococus Simulans产酶少且本身属于病原菌范围以及分子生物学技术的发展，在1987年美国的Recsei等通过分子克隆方法将溶葡萄球菌酶基因在大肠杆菌JM105、枯草芽孢杆菌及球形芽孢杆菌中进行表达。在大肠杆菌JM105中溶葡萄球菌酶的表达量为3ug/ml，其中65％在上清、15％在周质、20％在胞内。1990年获得了专利，专利号为4931390；内容为将1.5kbDNA编码的溶葡球菌酶片段插入载体pUC8、pBC16、pBD64、pSPV1形成重组质粒pRG5、pjp1、pDF8、pRP1。prg5转化大肠杆菌JM105。pjp1、pDF8、pRP1转化大量芽孢杆菌(枯草杆菌BD170、球形芽孢杆菌00)，产生的溶葡球菌酶经免疫、电泳与S.Simulans产生的溶葡球菌酶进行鉴定，而且球形芽孢杆菌转化子产生的溶葡球菌酶(150mg/L)是S.simulans的5倍。该专利也提供了1.5kbDNA序列，该DNA序列编码了389个氨基酸的前溶葡球菌酶前体蛋白，翻译后被加工成成熟的溶葡球菌酶。近年来发现，该酶的N末端是不均一的，大部分比野生型的少2个丙氨酸。

1996年德国的WALTER P.HAMMES等将删除了前体的溶葡萄球菌酶基因在Meat Lactobacilli(一种乳酸菌)进行表达。其删除前体的目的是为了能在Meat Lactobacilli中稳定的表达。专利号：EP0759473；1997年，但该方法仍属于是胞内表达。

1999年年印度生物技术国际有限公司申请了重组成熟溶葡萄球菌酶的表达专利，专利号WO 01/29201。其方法为删除了溶葡萄球菌酶的前体以及信号肽部分，直接在重组成熟溶葡萄球菌酶基因前加上起始密码子ATG(编码第一个氨基酸：甲硫氨酸)并克隆入pET11b的T7启动子之后，其表达需要通过IPTG诱导表达。该发明将溶葡萄球菌酶在大肠杆菌中是以包涵体形式表达，所表达的溶葡萄球菌酶以不溶解的包涵体的形式贮存在细胞当中，必须将细胞破碎后，才能将其分离出来，分离过程中要用蛋白质变性剂，最后还要再把蛋白质复性，复性过程中有许多分子会错接形成结构异常的分子，同时，菌体残余蛋白是基因工程药物生产过程中不易清除的物质，容易影响产品质量。

目前国外没能实现溶葡萄球菌酶基因在大肠杆菌中的高效外分泌表达，外分泌表达的优点在于表达产物以最终的活性形式存在于培养基中，无包涵体复性等步骤；从培养上清中纯化较简单，回收率高；宿主菌蛋白污染少。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，以克服现有技术的不足。

本发明的发明构思是这样的：

从60年代发现溶葡萄球菌酶至今，由于该酶对金黄色葡萄球菌特别是耐药性金黄色葡萄球菌的杀菌效果非常好，国内外一直都在对它进行人药用研究，并尝试申报新药。但是，由于重组溶葡萄球菌酶一直是通过球形芽孢杆菌表达，但该工程菌目前在药品中还没有得到允许使用，目前能作为人用药品的表达宿主菌主要为大肠杆菌和酵母菌，因而世界各国的研究人员为了申请新药都在试图解决这一难题。

多年来国内外一直尝试用大肠杆菌进行表达，但都表达未果。1997年德国科学家及2003年美国科学家曾经用乳酸杆菌代替球形芽孢杆菌来表达溶葡萄球菌酶，但乳酸杆菌也未批准在药品中使用，新药申报也遇到了困难，而且乳酸杆菌表达也是胞内可溶性表达且成本较高。