[发明专利]制备淀粉状蛋白β肽的共价交联的寡聚体的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于制备淀粉状蛋白β的稳定化交联寡聚体的组合物和方法，所述稳定化交联寡聚体用作生成抗体的免疫原，所述抗体用于治疗阿尔茨海默氏病和与异常淀粉状蛋白β聚集有关的其它状况。

发明背景

从人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)衍生出的肽，即淀粉状蛋白-β(Aβ)肽，在水溶液中自结合，以形成寡聚形式的复合物和异质混合物(Klein，W.L.等，Trends Neurosci.24：219-224(2001))。已经从合成的Aβ₄₂肽生产了一类这样的寡聚体，称作淀粉状蛋白-衍生的可扩散配体(ADDLs)(Chromy，B.A.等，Biochemistry 42：12749-12760(2003)。据报道，这些可溶的寡聚体与统称为阿尔茨海默氏病(AD)的神经毒性事件和症状有关，推测是通过尚未鉴别出的受体-介导的途径(Klein，W.L.Neurochem.Int.41：345-352(2002)。

在公开的文献中，已经以许多方式表征了ADDLs，但是最常见的是通过在凝胶电泳中的迁移模式和通过原子力显微镜(AFM)。在SDS-PAGE凝胶上，观察到与单体、二聚体、三聚体和偶尔来自Aβ₄₂肽的合成制剂的更高质量的寡聚体相对应的特征种类。在阿尔茨海默氏病模型中在动物的脑提取物中，已经观察到类似的结果。AFM清楚地区分球状的、可溶的寡聚体和伸长的原纤维的和初原纤维的形式。

已经普遍地认识到，Aβ肽制剂是动态的，即它们连续地经历结合和解离事件，最终产生高级的聚集体。AD患者死后脑中淀粉状蛋白斑形态学的流行病学关联，已经产生了该疾病与淀粉状蛋白原纤维的沉积有关的理论。但是，最近的研究已经提示，在没有斑沉积的情况下，相关的神经毒性和认知损伤事件由可溶寡聚体或ADDLs介导(Kirkitadze，M.D.等，J.Neurosci.Res.69：567-577(2002))。脑中的主要肽种类Aβ₄₀和Aβ₄₂表现出显著不同的聚集倾向，其中Aβ₄₀主要以单体状态存在。由于转基因动物模型中Aβ₄₂水平的升高与增加的AD-样表现相关联，所以认为Aβ₄₂的自结合是神经毒性的原因事件。合成肽的体外研究已经证实了Aβ₄₂与Aβ₄₀相比倾向于聚集的性质(Jarrett，J.T.等，Ann.NY Acad.Sci.695：144-148(1993))。由于单体Aβ种类存在于正常组织中，所以它们被视作免疫系统通常不识别的自身抗原。在有升高的Aβ₄₂浓度存在下的自结合导致寡聚体形成，且虽然现在还不知道这些寡聚体的结构形式，但存在2个或更多个单体肽的相互作用可生成不再被免疫系统识别为自身的新构象表位(新表位(neoepitope))的可能性。同样，在AD治疗的主动或被动免疫方案中，特异性地指向这样的构象表位的抗体应答可能是保护性的。

合成的淀粉状蛋白肽的确定制剂含有有毒的寡聚体(Klein，W.L.等，Neurobiol.Aging：25：569-580(2004))的观察使得可得到生产免疫原的方法，以达到定向抗体应答。但是，如果“照现在的样子(as is)”使用，产生的制剂可能在达到所需的抗体应答方面是次优的：(1)这样的制剂的不稳定性使它难以定义和靶向所需大小的寡聚体群体，因为系统是在流动状态；(2)相当大水平的单体的存在，可能具有有害作用，因为该种类被视作“自身的”，且大的量可能阻止寡聚体上新构象表位的识别；和(3)高水平的单体可能诱导针对单体和寡聚体共有的表位的应答。在后一种情况下，在生成的大多数抗体都识别分子的相同区域的意义上，抗体应答可能针对优势免疫表位。对于Aβ肽而言确实如此，因为已经报道了识别该分子的氨基末端(残基1-15)的几种单克隆抗体。尽管这可能不一定是有害的，但如果它们仅仅识别有毒的寡聚体组分、且不识别单体自身抗原，则会提高这样被动施用的抗体制剂的安全性水平。实际上，Pfeifer等报道，识别Aβ的残基2-6的单克隆IgG抗体的被动施用导致扩散淀粉状蛋白负担的显著减小，但是也导致脑淀粉状蛋白血管病-相关的出血的2-倍增加(Pfeifer，M.等，Science 298：1379(2002))。

本发明涉及改进的生成基本上不含有单体Aβ肽的、Aβ-衍生肽的共价稳定化的寡聚形式的方法，以用作生成治疗AD的抗体的免疫原。

发明内容