[发明专利]激光显微解剖方法和用于激光显微解剖的装置

说明书

本发明涉及一种激光显微解剖方法，以该方法借助于激光器的激光脉冲沿着封闭的切割线从放置在一个平面载体上的生物样品上切下切片。

本发明还涉及用于激光显微解剖的装置，其包含一个具有至少一个定义一个光轴的物镜的显微镜。此外设置一个发射激光束的脉冲激光器，该激光束经过物镜沿着光轴指向样品并且画出一条封闭的切割线。

在生物学和医学范围内有一种称为显微解剖的方法，以该方法用聚焦激光束从一个基本上扁平的样品(例如细胞、细胞培养物或组织切片)中切下一小部分，所谓的切片。为了激光切割将生物样品放置在一个平面载体上，例如玻璃载物片或聚合物薄膜。在切割之后切片提供给进一步的生物或医学(例如组织)检验使用。

在1976年5月Journal of Microscopy第107卷19至24页G.Isenberg、W.Bilser、W.meier-Ruge、E.Remy的文章“Cellsurgery by laser micro-dissection：a preparative method″中描述了这样一种激光显微解剖方法。在该文章中生物样品放置在一个载物片的底面。此生物样品是吸附在一个载物片上的细胞培养物。为了防止细胞固定黏附在基片上，使用了具有硅树脂涂层的载物片，其有助于降低在样品和载物片之间的附着力。所述载物片放在一台直立的、耦合了一个脉冲式氦-氖激光器的显微镜内。激光束聚焦在生物样品上。以该聚焦激光束沿着封闭的切割线通过接连排列通过激光脉冲形成的切割孔切下感兴趣的样品区域，即切片。在此切割基于已知的激光切除术原理，也就是说单独的激光脉冲在切割线上产生等离子体，所述等离子体“蒸发”样品物质。在此最后的激光脉冲使切片与周围的生物样品分离并且在此也导致切片在载物片上所要求的松动。然后切片在重力的作用下坠落并接放在一个收集器皿中并用于进一步的检验。

DE 100 43 506 C1描述该方法的改进方案。其中将需要检验的、要从中切下感兴趣的样品区域的样品在非常薄的塑料薄膜上制成标本。所述塑料薄膜的厚度在1-2μm数量级。PET薄膜和PEN薄膜可以用作材料。样品放入耦合了脉冲激光器的显微镜中。描述一个激光显微解剖方法，在该方法中切割线在切割临近结束时不完全封闭，而是在末端保留一个比较狭窄的并且同时稳定的桥。该桥防止薄膜与感兴趣的样品区域向聚焦平面外掀开并扭转。在割断该桥之前借助于一个光阑放大激光束的光圈，但不改变显微镜的观察口径。通过放大激光的光圈扩大激光束的切割宽度。同时激光束焦点的位置相对于样品保持在同样的位置不变。然后用加宽的激光光圈以最后的、已聚焦的、切割激光脉冲割断剩余的桥。在结束切割之后样品在重力作用下坠落并收集在一个收集器皿中。可是总体来说，在最后的激光脉冲之前停止切割线并且在最后的激光脉冲结束切割线之前，转换用于激光光圈的光阑，被证明是仪器技术上复杂的并且是费时的。由应用者确定一个适当的剩余桥并且指定一个合适的激光光圈也是不完全简单的，因此有时切片不能完整地独立制成标本并且必须重复切割。

此外在这两种方法中都观察到，在不改变设备设置(光学镜组、激光器参数、聚焦位置等)的情况下相继切割的切片在落入收集装置时不同程度地向旁边漂移。该收集装置例如可以是小样品管，市场上通常称为PCR管。结果是，切片黏附在PCR管的侧面内壁上，而不是落到管的底部。这使切片难以检查，这对于使用者，例如病理学家来说，在进一步处理已切割的切片之前是一个重要的工作步骤。

因此德国专利申请DE 103 46 458建议对样品的感兴趣的样品区域进行激光显微解剖的一个方法，在该方法中脉冲激光束的激光脉冲同样聚焦到样品上，并且在该方法中，在最后的、完成切割的激光脉冲中切除的主体与最后用来切割的激光脉冲的切割宽度匹配并优化，如此使得从等离子体传递到切片上的能量最大。然而在此在最后的激光脉冲之前停止切割线也使应用者感到费时。

美国专利6,773,903同样公开了切割所选择的生物样品区域的一种显微解剖方法。放置在载物片上的样品位于一个在x-y坐标平面内的可移动工作台上。在该显微镜内耦合激光束并使x-y工作台作相应移动，如此使得激光束围绕感兴趣的样品区域描绘一个相应的封闭的切割线。由此将感兴趣的生物物质与生物样品分离。可是x-y工作台的控制在机械上是复杂的并且不能相应在x-y平面内的激光束那样准确地控制，以将生物物质与其余样品分离。

因此本发明的技术问题是，给出一个激光显微解剖方法，其在艰难的样品标本制作中能够以进一步改善的切割结果更舒适、更快捷地切下切片。