[发明专利]核酸扩增和磁性检测无效
申请号: | 200680020457.2 | 申请日: | 2006-06-07 |
公开(公告)号: | CN101194024A | 公开(公告)日: | 2008-06-04 |
发明(设计)人: | M·W·J·普林斯;A·范阿梅龙根;M·科特斯 | 申请(专利权)人: | 皇家飞利浦电子股份有限公司 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 永新专利商标代理有限公司 | 代理人: | 林晓红 |
地址: | 荷兰艾*** | 国省代码: | 荷兰;NL |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 核酸 扩增 磁性 检测 | ||
本发明涉及定量扩增的核酸序列例如扩增的DNA和RNA或参与扩增过程的试剂的领域,且特别涉及用于定量扩增的核酸序列例如扩增的DNA和RNA或参与扩增过程的试剂的方法和装置。本发明还涉及生物分子磁性检测领域,且特别涉及用于生物分子磁性检测的方法和装置。
通过使用生物化学扩增方法可以非常敏感和特异地测定出核酸(RNA、DNA)。核酸扩增和随后的检测是复杂的过程,其一般需要多个处理步骤。为了检测出生物材料(例如微生物),这些步骤通常包括(选择性)富集、分离/纯化和鉴定。在简化过程和提高分析性能(例如敏感性、特异性和速度)方面都做了很大的努力。例如,已经显示可以用配体蛋白通过分子生物学技术和免疫测定法的组合敏感地和特异地检测RNA/DNA扩增产物。对于信号发生,其他检测法都用荧光、化学发光或多种(免疫)传感器检测器取代比色法。但是,绝大多数所开发出的检测法都是相对复杂的、昂贵的和/或需要(高精的)仪器。
已经开发出了简化的提取和扩增方法与侧流免疫测定(LFIA)检测法的组合,其比凝胶电泳的敏感度高出数个数量级,并且在5到15分钟内得到结果。原则上讲,LFIA适用于多分析物检测,即在一个检测设备中筛选最多6个特异的RNA/DNA序列。基于黑胶粒和固定于硝基纤维素膜上的特异性配体的方法使得能够在迷你阵列装置中检测出5到30个不同的参数。通过平台式扫描和图像分析可以使得结果数字化。
定量方面和测量值的动态范围是生物化学扩增中的一个重要问题。这在指数式扩增法例如PCR中尤为突出,指数式扩增法在亚检测水平的扩增子浓度和生物化学扩增法的饱和状态之间有着非常陡峭的转换。结果常常是是或否的答案,而不是靶浓度的精确数值。
改良的方法是实时PCR,其中在指数式生物化学扩增过程中可以动态地测定(例如用分子标记)出扩增子的浓度。在定量实时PCR中,利用专用探针设计、过程控制和过程监测得出定量数据。从发生特定信号所需的时间中推导出初始靶浓度。定量实时PCR的缺点是(i)复杂的测定过程;(ii)每次测试的昂贵的花费水平,和(iii)难以实施多路测定。
在其所广泛使用的形式中,上述方法(ELISA、LFIA、实时PCR)都涉及光学检测。光学检测有着一些缺点例如:
-高的背景信号(例如来自底物或装置材料、来自样品材料或来自测试装置中的生物学材料的自发荧光),特别是当使用复杂的生物学样品时。
-标记物性质取决于生物化学环境(例如荧光效率),其会使得测量值的定量复杂化。
-盒(cartridge)和读取器之间的相互联系容易发生错误。
-来自装置和液体样品的光散射。
-入射光和发射光/反射光的吸收取决于液体的光学性能。
-有时需要昂贵的读取设备。
存在不同于基于光的检测的其他检测方法。例如,正在研究检测磁性纳米颗粒的磁性传感器的生物诊断用途,这是因为其有着下面预期的优点:高分析性能(敏感性(生物材料具有非常低的磁性背景,可以得到非常敏感的传感器))、速度(归功于磁性促动)、特异性(归功于力鉴别(force discrimination))、组合测定步骤(例如靶向提取和检测,两者都使用磁性颗粒)、以及容易使用(简单和可靠的电子互联、传感器和读取器都是紧凑的和廉价的)。
在联合核酸扩增和磁性检测方面进行了初步尝试。WO00/61803公开了核酸扩增和紧接其后的磁性传感器芯片检测的组合。该方法包括通过磁力施加严格性。解决方案特别集中于链置换扩增法(SDA)。EP0781346公开了一种方法,其中磁性检测法与PCR扩增交替进行。磁性检测依据于磁性标记引物和扩增的DNA之间的迁移差异。
针对基于光的检测的缺陷,需要基于利用磁性传感器和磁性颗粒的其他检测方法的快速的、敏感的、定量的、高动态范围的和实时的核酸检测方法。这些方法应当包括尽可能少的步骤,即具有生物化学过程和检测的最大整合。
本发明涉及用于扩增核酸即RNA或DNA和测定所扩增的RNA或DNA或参与扩增过程的试剂的量的方法和工具。在这个方法中,通过磁性检测实施确定扩增的核酸或参与扩增过程的试剂的量的步骤,并且在所述RNA或DNA的扩增过程中至少实施1次所述确定步骤。在本发明的方法中,通过其中所扩增的核酸或所述试剂通过一或多种生物分子与传感器相结合的方法实施确定所扩增的核酸或参与扩增过程的试剂的量的步骤。
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