[发明专利]具有产生聚乳酸酯或其共聚物能力的细胞或植物及制备聚乳酸酯或其共聚物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有产生聚乳酸酯或其共聚物能力的细胞或植物以及用该细胞或植物制备聚乳酸酯或其共聚物的方法，更具体地，本发明涉及能够表达编码把乳酸酯变为乳酰-辅酶A的酶的基因和编码与PHA合酶相关的酶基因的细胞或植物，并且本发明涉及一种制备聚乳酸酯或羟基脂肪酸酯-乳酸酯共聚物的方法，该方法包括：在含有乳酸酯、提供碳源的羟基脂肪酰-辅酶A或乳酸酯和各种不同的羟基脂肪酸酯的培养基中培养该细胞，或培养该植物。

背景技术

聚乳酸酯(PLA)是一种典型的生物可降解的由乳酸酯产生的聚合物，其作为普通或医药聚合物有着多种用途。目前，是通过由微生物发酵产生的乳酸酯的聚合来制备PLA，但经乳酸酯的直接聚合作用只能制备低分子量的PLA(1000-5000道尔顿)。为合成高分子量(＞100,000道尔顿)的PLA，可以使用利用链偶联剂将直接聚合乳酸酯得到的低分子量的PLA聚合以获得高分子量PLA的方法。但其缺点在于，由于需加入溶剂或链偶联剂并且其不易被去除，制备高分子量PLA的过程是复杂的。目前，在制备市售可得的高分子量PLA的过程中，使用的是把乳酸酯转变为丙交酯以通过丙交酯环的环化脱水作用来合成PLA的方法。

同时，PHA是微生物在其体内聚集的聚酯，当其他营养元素缺乏(例如磷、氮、镁、氧)而碳源过量时，PHA被作为碳和能量的储备化合物。由于具有同产自现有石油的合成聚合物类似的特性，同时表现出极好的生物降解率，PHA被认为是现有合成塑料的替代材料。

现有的PHA分为具有短碳链的SCL-PHA(短-链-长度PHA)和具有长碳链的MCL-PHA(中等-链-长度PHA)。自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)和假单胞菌(Pseudomonas)克隆了合成PHA的基因，并且通过重组微生物合成了由各种不同的单体组成的PHA(Qi等人，FEMS Microbiol.Lett.，157：155，1997；Qi等人，FEMS Microbiol Lett.，167：89，1998；Langenbach等人，FEMS Microbiol.Lett，150：303，1997；WO 01/55436；US 6,143,952；WO 98/54329；WO 99/61624)。

为在微生物体内制备PHA，需要将微生物的代谢产物转变为PHA单体的酶，以及利用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。PHA合酶用羟酯酰辅酶A为底物合成PHA，并且由富养罗尔斯氏菌等克隆的β-酮硫解酶(PhaA)和乙酰乙酰-辅酶A还原酶(PhaB)、由假单胞菌属克隆的3-羟基癸酰-ACP：辅酶A转移酶(PhaG)、产自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)和铜绿假单胞菌(Pseudomona aeruginosa)的(R)-特异性烯酰-辅酶A水合酶(PhaJ)(Fukui等人，J.Bacteriol，180：667，1998；Tsage等人，FEMS Microbiol.Lett.，184：193，2000)、产自大肠杆菌(E.coli)和铜绿假单胞菌的3-酮酯酰-ACP还原酶(FabG)(Taguchi等人，FEMS Microbiol.Lett.，176：183，1999；Ren等人，J.Bacteriol，182：2978，2000；Park等人，FEMS Microbiol Lett.，214：217，2002)被认为是能提供作为PHA底物的羟酯酰-辅酶A的酶。使用这些酶，通过在碳链的各种不同的位置(主要是3，4，5，6位)羟基化的羟基脂肪酸酯来合成各种不同的PHA。

但是，有报道称对2-位上被羟基化的羟基脂肪酸酯几乎没有PHA合酶活性(Zhang等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，56：131，2001；Valentin和Steinbuchel，Appl.Microbiol.Biotechnol，40：699，1994；Yuan等人，Arch.Biochem.Biophyics.，394：87，2001)。到目前为止，通过体外测量PHA聚合酶对乳酰-辅酶A的活性对PHA合酶的活性有报道，但PHA合酶对乳酰-辅酶A的活性非常弱(Zhang等人、Appl.Microbiol.Biotechnol，56：131，2001；Valentin和Steinbuchel，Appl.Microbiol.Biotechnol，40：699，1994)。也就是说，由于例如在2-碳位羟基化的乳酸酯的羟基脂肪酸酯不适于作为PHA合酶的特定底物，还没有自然制备或使用重组细胞或植物制备PHA及其共聚物的例子。