[发明专利]凝血酶纯化

说明书

本申请是递交日为2005年5月26日、美国专利申请11/140,374 的部分继续申请，在此将其全文引用作为参考。本申请还将申请日为 2006年5月24日、题为“凝血酶纯化”的部分继续美国专利申请全文 引用作为参考。本发明要求递交日为2005年5月26日、美国专利申 请11/140,374以及申请日为2006年5月24日、题为“凝血酶纯化” 的部分继续美国专利申请的优先权。

1.发明领域

制备物本发明涉及纯化凝血酶的制备物，其基本上不含对患者产 生副作用的大分子量杂质，例如因子Va，朊病毒和/或病毒介质。本发 明还涉及制备基本上不含病毒介质、具有较高纯度和较高比活性的凝 血酶的方法。更具体地，本发明包括含有从凝血酶制备物中排除高分 子量杂质的方法。本发明还涉及具有较高纯度，较高比活性和稳定性 的凝血酶制备物的制剂。

2.发明背景

凝血酶是一种蛋白水解酶，其是由于凝血酶原蛋白水解在凝血系 统活化之后出现在血液中。通过催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形 成血凝块，并释放出纤维蛋白肽A和B，凝血酶协助血液的凝固。在 血管系统失调之后，凝血酶的产生对于凝血过程而言是至关重要的。

凝血酶制备物已获得FDA的批准，可以局部施用从而作为对当出 现来自于毛细血管的渗血或少量流血时的体内稳定状态的辅助措施， 且可以到底小静脉。商业可获得的凝血酶的局部施用显著加速血液的 凝固并显著的缩短了凝固的时间。

使用低纯度凝血酶制剂的研究表明凝血病可以在患者对暴露于低 纯度，局部凝血酶制剂的应答中出现。在商业可获得的凝血酶制备物 中通常存在的杂质包括因子Va，牛血清白蛋白(BSA)，以及其他高分 子量蛋白。商业牛凝血酶制剂中的因子Va污染可以刺激患者产生抗牛 因子Va的抗体，其可与患者自身的因子Va交叉反应，从而导致受损 的止血作用。

凝血酶的凝血强度是以单位/ml进行测定的。所述样本的浓度越 高，效力越大，凝血(或产生纤维蛋白原)就越快。比活性是样本的效力 除以其蛋白含量的比值且以单位/毫克蛋白进行表达。

凝血酶的比活性依赖于所述凝血酶的纯度。当与具有较低纯度的 制备物进行比较时，具有较高纯度的凝血酶在比活性方面表现出了增 加。

在此之前，对凝血酶的纯化一般局限于使用常规的离子交换层析。 美国专利5,397,704描述了牛的凝血酶制备物，其是使用一系列阴离子 和阳离子交换层析制备的。

美国专利5,151,355描述了牛凝血酶制备物，其是通过将1单位的 凝血酶原与低于5单位的促凝血酶原激酶在存在钙的条件下进行反应 而制备的。然后向将所述凝血酶依次施加于阴离子交换琼脂糖柱和阳 离子交换琼脂糖柱。

美国专利4,965,203公开了纯化牛凝血酶的方法，其中将所述凝血 酶通过一系列离子交换层析柱，然后使用聚醇和缓冲液进行配制。虽 然上述的凝血酶制备物被认为是具有较高的比活性，但这样的纯化方 案并未提供任何有效去除高分子量杂质的手段。

美国专利申请公开2001/0033837公开了使用疏水相互作用层析， 然后任选通过阳离子交换层析纯化凝血酶制备物的方法。尽管所述纯 化凝血酶的方法包括疏水相互作用层析，但所述用于纯化和去除病毒 的方法并不能够达到本发明所包括的病毒去除和比活性或纯度。

所以，需要能够被用于制备具有较高纯度凝血酶的方法。因此， 所述纯化的凝血酶具有较低水平的高分子量杂质，例如因子Va，以及 较高清除界限的病毒介质和朊病毒。

尽管具有较高纯度的凝血酶可进行更安全的使用，因为诸如因子 Va和BSA的杂质得以降低或消除，但高纯度的凝血酶依然难以被配制 成稳定的制剂。凝血酶越纯，其稳定性就越低且越难以被配制成稳定 的制剂。因此，亟需含有具有较高纯度和较高比活性的凝血酶的稳定 制剂。

3.发明内容

本发明涉及凝血酶组合物以及制备这些组合物的方法。如本说明 书所述，术语制剂，组合物和制备物可以相互替换使用。本发明所涵 盖的制剂，组合物和制备物包含有凝血酶，优选为具有提高纯度的凝 血酶，还含有额外的赋形剂，特别是那些赋予所述制剂，组合物或制 备物稳定性的赋形剂。