[发明专利]测定植酸酶活性的方法

说明书

本发明涉及分析植酸酶活性的方法，涉及在此方法中一类芳香磷酸酯/盐化合物的应用，涉及实施此方法的试剂盒，并涉及可用于此方法的全新化合物和组合物。

植酸酯是谷类和豆类中磷的重要储存形式。然而，单胃动物，如猪、家禽和鱼不能代谢或吸收植酸酯(或植酸)，因此将其排泄出来导致高密度家畜生产区域的磷污染。而且，植酸也通过与如钙、铜和锌等金属螯合成为单胃动物体内的抗营养剂。

为这些动物的生长和健康提供足够的磷而在其饲料中添加了无机磷酸盐。如此添加成本高，并且进一步增加了污染问题。

植酸酯被植酸酶转化，该酶通常催化植酸酯水解为低肌醇-磷酸酯和无机磷酸盐。植酸酶可用作动物饲养的添加剂来提高有机磷对动物的可用性并降低对环境的磷污染(Wodzinski R.J.，Ullah A.H.，Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。

文献中已对真菌中的一些植酸酶(Wyss M.et al.Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)；Berka R.M.et al.Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S.et al.Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和细菌中的一些植酸酶(Greiner R.et al Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo et al.Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.et al.Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R.et al.Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.et al.Enzyme andmicrobial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.et al.FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004)))进行了描述。

已知的在溶液中分析植酸酶的方法是基于对酶-催化水解反应中，从植酸释放的正磷酸盐的检测。磷酸盐通常在硫酸中与钼酸盐反应后，通过分光光度检测(例如Heinonen J.K.，Lahti R.J.Anal.Biochem.113，313-317(1981))。此方法灵敏但需要使用腐蚀性试剂(硫酸)和易燃试剂(丙酮)，也不适用于分析粗植酸酶制品或含游离无机磷酸盐的天然样品中的植酸酶活性。而且，基于磷钼酸盐的方法不能用于检测生长在固体培养基上的活微生物菌落的植酸酶活性。

这样的“板上”分析对分离和开发产植酸酶的微生物菌株特别有用。现有技术中已有大量开发用于检测植酸酶活性的“板上”技术的尝试。基于溶解不溶性植酸盐的方法(Shieh TR and Ware JH.Appl.Microbiol.16(9)1348-1351(1968)；Bae HD et al.J.Microbiol.Methods.39，17-22(1999))不但不灵敏而且受限于微生物生长期间培养基酸化产生的假阳性信号。基于刺激其中植酸为唯一磷源的营养板上的磷酸依赖性、无植酸酶的报告基因细菌的生长的方法(Chen JC.Biotechnology techniques 12(10)759-761(1998))缓慢并且分辨率一贯不佳，原因是检测细菌生长需要长期培养使得磷酸酯扩散。

相反，在含有过量无机磷酸盐和/或在固体微生物营养基表面上检测磷酸酶活性是简单而高效的。基于显色磷酸酶底物，如α-萘基磷酸酯、对硝基苯基磷酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯的方法是本领域已知的，并且这些底物均可购得(例如，购自Sigma-Aldrich)。然而，这些底物与植酸酶的作用均不令人满意。

仍未解决的问题是提供可用于检测活微生物菌落和粗植酸酶制品的植酸酶活性的分析方法。

另一个仍未解决的问题是提供可用于检测植酸酶活性的分析方法，其不使用腐蚀性试剂和/或易燃试剂。

本发明致力于/减少现有技术中的这些问题。

根据第一方面，本发明提供了检测样品中植酸酶活性的方法，其包括：

i)将所述样品与植酸酶底物结合，以及

ii)测量所述植酸酶底物的有机代谢物的水平。

根据第二方面，本发明提供了检测样品中植酸酶活性的试剂盒，其包括植酸酶底物和显示试剂。