[发明专利]具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有三螺旋结构的蛋白质的生产方法。更具体地，本发明涉及生产人类胶原或人类胶原部分肽的生产方法。本发明的目的是提供一种对活体安全的并且可以轻易地纯化并获得的人类胶原或人类胶原的部分肽，以及它们的生产方法。更具体地，本发明通过稳定地将插入了人类胶原cDNA的哺乳动物表达载体转导到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，提供了人类胶原和其部分肽的生产方法。

背景技术

胶原是一种蛋白，该蛋白分布于包括皮肤，骨头和软骨在内的几乎所有的身体组织中，并且公知具有重要的功能，例如通过为细胞提供支架构造来维持组织和器官的结构。同时，胶原是生物可吸收的材料，其可通过成纤维细胞分泌的胶原酶和存在于噬菌细胞中的胶原酶所降解。胶原被认为是非常有用的生物材料，因为它是如上所述的生物相容和生物可吸收的材料。目前，胶原已作为生物材料用于涂覆受伤的皮肤并且据报道可促进复原(非专利文献1和2)。

全部胶原的40％存在于皮肤之中，皮肤和腱干重的70％或更多为胶原；因此，胶原对于开发人造皮肤非常重要。它作为有用材料被应用于细胞和器官的培养技术中，在快速发展的再生医学领域中其应用具有广阔的前景。还需指出的是通过口服方式，胶原(II型胶原)可用于抑制关节风湿病(非专利文献3和4)。作为这种胶原的原材料，主要使用了那些来自大型非人类动物(如猪和牛)组织的胶原。

[非专利文献1]Surg.Forum，10，303(1960)

[非专利文献2]J.Surg.Res.，10，485-491(1970)

[非专利文献3]Lancet，342，799(1993)

[非专利文献4]Science，261，1727-1730(1993)

[专利文献1]日本专利申请公开公报(JP-A)H 10-179169(未审查，公开的日本专利申请)

发明内容

如上所述，胶原作为生物材料或药物对于再生治疗和活器官移植非常有用，但是，到目前为止所用的胶原来自大型非人类动物如猪和牛的组织中。虽然胶原是生来具有低免疫原性的蛋白质，但是据报道当来自于异种动物的胶原作为生物材料被移植，被植入或给药时，诱导了较低频率的免疫反应(J.Immunol.，136，877-882(1986)，Biomaterials，11，176-180(1990))。另外，由于牛的朊病毒污染的问题，源自牛的胶原的应用已经不可能了。此外目前用于胶原提取的动物(例如猪)中无法保证类似于朊病毒污染的问题不会发生。从以上提及的几方面，优选将人类来源的胶原作为生物材料直接应用于人体。然而，从人类组织中提取和纯化胶原不仅具有伦理和技术的问题，而且还有得到的胶原为非特定的交联形式的质量上的问题并且难于纯化。

为了获得无病原污染的并且易于分离和纯化的非免疫原的胶原，已经开发出了使用基因重组技术生产胶原(Biochem.Soc.，28，350-353(2000))。但是，用于将编码分子量超过100,000的胶原分子的cDNA引入宿主细胞的表达载体的制备是非常复杂的。另外，常规方法的生产力低，并且还不能实际应用。此外，已知胶原分子具有三个肽缔合的三螺旋结构。该结构为对基因的初级转译产物进行若干修饰的结果而形成的(N.Engl.J.Med.，311，376-386(1984))；但是，只有特定的细胞被认为具有这种修饰能力。

多种尝试通过使用小鼠的成纤维细胞，仓鼠的肺细胞等等作为宿主来生产重组人类胶原(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，84，764-768(1987)，J.Biol.Chem.，264，20683-20687(1989))。虽然在这些例子中生产的胶原具有通常的分子结构，但是它们是来自于人类和宿主细胞的胶原基因产物的混合胶原分子。在表达了人类II型胶原的例子中(Biochem.J.，298，31-37(1994))，产物的量少至每升培养基中0.5～1mg，并且发现通过引入的cDNA表达的II型胶原被大量的宿主来源的IV型胶原污染。因此，必须从源自被引入基因的II型胶原中将内源的II型胶原分离。