[发明专利]诱导胚胎干细胞为胰腺细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导胚胎干细胞方法，包括以下顺序的步骤：

在细胞培养基中培养胚胎干细胞以形成胚体；

利用激活蛋白A孵育所述胚体；和

利用RA孵育所述胚体，使其发育为产胰岛素的前体细胞。

2.权利要求1的方法，其中当胚胎干细胞来源于小鼠时，所述培养基为含有约10％胎牛血清的DMEM；当胚胎干细胞来源于人时，所述培养基为CDM。

3.权利要求1的方法，其中所述激活蛋白A的浓度为约50-300ng/ml培养基；所述RA的浓度为约1×10^-7-1×10^-5mol/L培养基。

4.权利要求3的方法，进一步包括以下步骤：在细胞培养基中培养胚胎干细胞以形成胚体的步骤前，用Metrigel包被用于容纳培养基的培养容器。

5.权利要求4的方法，其中所述metrigel在培养基中的质量百分比大约为1％。

6.权利要求5的方法，其中所述胚体与激活蛋白A一起孵育20小时到4天，再在不含激活蛋白A的培养基中培养6-8小时，然后用RA孵育20小时到4天，使其发育为产胰岛素的前体细胞。

7.权利要求6的方法，进一步包括以下步骤：在含有成熟因子的培养基中孵育获得的产胰岛素的前体细胞，以扩增产胰岛素的前体细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述成熟因子包括bFGF。

9.权利要求8的方法，其中所述bFGF的浓度为8-12ng/ml。

10.权利要求9的方法，进一步包括以下步骤：在含有N2增补剂、B27增补剂、层粘连蛋白和烟酰胺的培养基中孵育所述扩增了的产胰岛素的前体细胞以使其发育为产胰岛素的细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述培养基为在含有N2增补剂、B27增补剂、1μg/ml的层粘连蛋白，10ng/ml的bFGF，胰岛素-运铁蛋白-硒-A(1∶100)和10mmol/L的烟酰胺的DMEM/F12或CDM。

12.一种诱导胚胎干细胞的试剂盒，包括激活蛋白A和RA。

13.权利要求12的试剂盒，进一步包括Metrigel。

14.权利要求13的试剂盒，进一步包括一种一级培养基。

15.权利要求14的试剂盒，进一步包括血清。