[发明专利]基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2－脱氧－青蟹肌糖的制备方法及2－脱氧－青蟹肌糖的精制方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2-脱氧-青蟹肌糖(scylloinosose)的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法。

背景技术

目前在石油化学领域中，开始以石油作为原料生产六元碳环化合物。另一方面，在丁酰苷菌素(butyrosin)生产菌环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)中发现了2-脱氧-青蟹肌糖合成酶(DOI合成酶)，该酶可催化以葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)为基质，合成六元碳环化合物2-脱氧-青蟹肌糖(以下也称为DOI)的反应(图1，专利文献1)。

DOI合成酶是参与含有2-脱氧链霉胺作为苷元的氨基糖苷抗生素的生物合成的酶，其生成物DOI是作为医药原料或化学工业资源有用的物质。化学合成DOI的方法使用多步反应和有害或昂贵的金属，与其相对，如果使用DOI合成酶，则能够用较短的工序高效率地生产DOI。目前已经确立了使用通过在大肠杆菌中表达DOI合成酶而获得的重组DOI合成酶，用较短工序由葡萄糖-6-磷酸生产DOI的方法(专利文献1)。并且，已知DOI可以通过下述反应合成，即，使己糖激酶和DOI合成酶与葡萄糖作用的二步酶反应、或使DOI合成酶与葡萄糖-6-磷酸作用的一步酶反应(专利文献1、非专利文献1)。另外，也有报道指出，浓缩酶反应液后制成乙酸溶液，与碘化氢作用，由此可以在不精制DOI的情况下变为儿茶酚(专利文献1)。

但是，使用嵌入DOI合成酶的大肠杆菌、以来自生物质(biomass)的D-葡萄糖为原料、通过发酵进行DOI合成的方法，尚未作为课题被提出。

目前为止，已有报道指出可通过酶反应合成DOI，变为反应组合物状态的DOI，但精制·分离DOI本身的方法未见报道。并且，完全没有公开关于从含有比酶反应液中多种多量的培养基成分、作为碳源的葡萄糖、除此之外还含有来自蛋白胨等的氨基酸类、或各种金属离子类的微生物培养液中精制DOI的信息。即。目前的现状为，没有在来自酶反应液及微生物培养液等的杂质的存在下精制DOI的相关报道，或尚未确立可工业应用的精制方法。

为了在来自微生物培养液等的杂质的存在下精制DOI，已知有实验室规模的通过HPLC分离或采用活性炭柱色谱的方法。但是，不言而喻通过HPLC分离不适于工业生产。另外，采用活性炭柱色谱的方法中，使培养基中的有机化合物都吸附到活性炭上后，边改变醇等有机溶剂的浓度，边利用吸附力的差别使其顺次洗脱。所以，生产大量的DOI时，必须有足以吸附培养基中大部分有机化合物的量的活性炭，此方法也不适于大量精制。由此可知，目前为止尚未确立用于精制DOI的适当的工业方法。

专利文献1：特开2000-236881号公报(专利第3122762号)

非专利文献1：K.Kakinuma、E.Nango、F.Kudo、Y.Matsushima、及T.Eguchi著、Tetrahedron Letters、2000年、41卷、p.1935-1938

非专利文献2：Ota，Y.等著，J.Antibiot.、2000年、53卷、1p.158-1167

非专利文献3：Kudo，F.等著、J.Antibiot.、1999年、52卷、p.559-571

发明内容

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供能够实现可以工业规模制备DOI的体系的基因表达盒、具有此基因表达盒的转化体及2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法。

本发明的基因表达盒的特征在于，由参与2-脱氧-青蟹肌糖的合成的基因构成。

本发明的基因表达盒的特征在于，所述参与2-脱氧-青蟹肌糖的合成的基因是2-脱氧-青蟹肌糖合成酶。由此，可以获得能够工业制备DOI的转化体。

另外，本发明转化体的特征在于，该转化体是向宿主细胞中导入上述基因表达盒而获得的。

本发明转化体的特征在于，所述宿主细胞是选自大肠菌种、及GILSP基因重组微生物表记载的宿主细胞(平成18年3月公告表中记载的细胞)中的宿主细胞。由此，可以实施能工业制备DOI的方法。

本发明转化体的特征在于，所述宿主细胞是基因被破坏的宿主细胞，所述基因选自编码磷酸葡糖异构酶的pgi基因、编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的zwf基因、编码磷酸葡糖变位酶的pgm基因、及编码处于稳定期的负责蛋白质合成修饰的核糖体修饰因子蛋白质的rmf基因中的至少一种。由此，除上述之外，还能够实施能以较高效率工业制备DOI的方法。