[发明专利]作为疫苗的复制缺陷型RNA病毒

说明书

描述

本发明涉及复制缺陷的且有转录能力的负链RNA病毒，其可用于表达转基因和尤其用于疫苗开发领域。

用活疫苗进行免疫可模拟天然的感染并产生全面的免疫应答。在疫苗接种中使用减毒的但能够增殖的病毒。疫苗病毒的增殖必须缓慢进行以便免疫应答以及因此对病毒的增殖和/或清除的控制得到保证。活疫苗构思已多次在各个不同年龄组中得到证明。然而，存在重要的目标群体，对于这些群体，用活疫苗进行免疫是有问题的并且需要额外的安全措施：母体抗体在生命的最初几个月内保护婴儿。同时，它们是在活免疫接种中必须克服的屏障，尽管另一方面不会出现疫苗病毒的过度增殖和与之相关的疫苗接种性损害。另一个目标群体是老年人，他们的免疫系统不再那么有效，从而可能会出现通过疫苗接种而产生过载，和通过疫苗病毒增殖增加而出现疫苗接种性损害。因此，存在这样的问题：使免疫学上优异的活疫苗接种在特定目标群体中的应用更安全，以及增加总体应用的安全特性。

若干年以来，已经可以通过反向基因技术来有目的地改变负链RNA病毒，例如狂犬病毒或仙台病毒(SeV)。EP-A-0702085描述了从克隆的cDNA产生重组的、传染性的、复制性的、不分节段的负链RNA病毒。EP-A-0863202描述了一种重组仙台病毒，在所述仙台病毒的基因组中插入了一个异源基因或者删除或失活一个基因，但是它的基因组复制依然是完整的。

负链RNA病毒特别适合作为疫苗的骨架，因为它们在细胞质中的增殖在RNA水平上发生并且病毒基因组内的基因可以简单地交换。因此，已经成功地产生了具有多种病毒类型的表面蛋白的重组病毒并且在动物试验中用作疫苗(Schmidt等人，J.Virol.75(2001)，4594-4603和WO 01/42445)。通过将人副流感病毒3型(hPIV 3)的F-和HN-蛋白以及呼吸道合胞病毒(RSV)的G-或F-蛋白重组插入至基于牛副流感病毒3型(bPIV 3)的载体中，可以在仓鼠中施用后检测到针对hPIV 3和RSV的粘膜免疫应答。因此，已经实现了这种在动物试验中测试的活疫苗的二价抗原性。

由于涉及物种屏障，这种具有人PIV3-和RSV-表面抗原的牛副流感病毒对于在人中使用应当已经经充分减毒。回复为野生型是不可能的，因为全部基因换成了病毒表面蛋白。所述疫苗的临床试验已经开始。

然而，由于所述的病毒突变体是能复制的，所以在免疫接种者中无疑将会发生病毒增殖，增殖的强度虽然可通过修饰病毒而削弱，但不能够完全消除。因此，预期的病毒血症的强度和因此免疫接种者遭受副作用取决于个体因素。

在本发明范围内，将试图显著降低活疫苗接种的风险，特别是来自特定目标组的疫苗接种者的风险。

为此，一种方法是在施用疫苗后抑制病毒基因组复制。由此，不依赖于疫苗接种者的免疫效率，病毒的增殖和相应的疫苗接种性损害将不会发生。

这种方法的一个主要困难是病毒RNA聚合酶行使两种功能：病毒mRNA的合成和病毒基因组的增殖。在新疫苗中必须放弃这种偶联，因为疫苗现在必须只能够合成病毒mRNA。

另一个问题是，为了完全适合作为活疫苗，重组病毒必须导致有效的病毒mRNA合成。因此，存在两个根本上矛盾的需求，这意味着在制备安全但有效的基于负链RNA病毒的活疫苗中预期会有相当大的困难。

Shoji等人(Virology 318(2004)，295-305)描述了P基因缺陷型狂犬病毒的制备和表征。该病毒借助于表达P-蛋白的辅助细胞来产生。不从头合成P-蛋白，该病毒只能够初级转录。轻微的病毒基因表达在免疫荧光中表现出非常弱的关于N-蛋白的信号并且仅在非常少的细胞中显示，并且这种轻微的病毒基因表达的更令人信服的证明将只能通过PCR分析来提供。在小鼠模型中的攻击试验中使用这种病毒突变体将显示出保护作用，但是使用转录失活的病毒的对照试验确不是这样，并且所考虑的病毒攻击的时间间隔太短。推测的保护作用的持续时间未经研究。因此，将这种病毒突变体用于开发减毒的狂犬病疫苗看上去不是非常有希望的。

在导致本发明的研究的范围内发现，在副粘病毒中，复制和转录功能的分离可以通过部分除去对于基因组复制功能来说不可缺少的聚合酶的成分而实现。在此，该成分可以是病毒蛋白N、P和L之一，或者是此类蛋白质的特定功能结构域。

令人惊讶地发现，通过其中由病毒基因N、L和/或P编码的蛋白质的功能不是完全而是部分除去的突变，可以产生复制缺陷型RNA病毒，所述病毒拥有足够的转录功能从而适合用于制备活疫苗。